1、,第二章 植物组织与细胞培养,2.1 植物组织与细胞培养区别组织培养概念：指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。细胞培养概念：植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。,2.2 植物组织的发展简史,探索阶段（本世纪初30年代中） 1902年，德国植物生理学家Haberlanclt首次进行了细胞培养实验 奠基阶段（3050年代） 1934年，White 等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。 1943年White正式提出植物细胞具有全能性学说，即单细胞经过人工培养，通过细胞分裂能恢复完整植株。 1934年，White
2、 和Went 等分别发现B族维生素和吲哚乙酸（IAA）对培养的离体根生长具有重要作用。1937-1938年， Gautheret、Nobecourt 培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖。,White、Gautheret、Nobecourt 等科学家被誉为植物组织培养的奠基人 1957年Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生长素和细胞分裂素高促进根的分化，低促进茎和芽的分化。1958年，施图尔德从胡萝卜愈伤组织获得单细胞，并经诱导形成了胚
3、状体再生了植株，是世界上首次证明植物细胞的全能性。迅速发展阶段（60年代后） 1、原生质体培养和细胞融合。 2、微繁技术,2.3 植物组织培养重要概念和理论基础,植物组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，统称为植物组织培养 。,植物组织培养理论基础一、细胞全能性二.细胞分化 三.离体培养中细胞的脱分化、再分化,全能性：任何有完整的细胞核的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，理论上都能发育成为一棵植株。 植物组织培养是建立在细胞具有全能性的理论基础上的，除受精卵
4、能发育成胚外，植物的体细胞，雌配子、雄配子体都能发育成胚。,植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞) 特化细胞(筛管、导管细胞)； 根据细胞所处的组织不同从强到弱为： 顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织) 厚角组织 输导组织 厚壁组织。,脱分化 再分化 外植体愈伤组织 体细胞胚 根、茎、叶 等器官再分化时，可经过两条途径,完整植株,外植体：植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞或原生质体。愈伤组织：由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。,二、细胞分化分化：细
5、胞的这种在形态结构和功能上发生永久性（不可逆转性）适度变化的过程。分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随的是细胞的分化成熟与组织的形成，是植物根、茎、叶、花、果实和种子的形成，是一个成熟植物体的出现。,三.离体培养中细胞的脱分化、再分化脱分化：由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织的现象。再分化：由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的组织，构成一个完整的植物体或植物器官的现象,一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。,影响细胞脱分化、再分化的因素A、激素 生长素能促进
6、维管组织形成 细胞分裂素与木质部的发生有关b、蔗糖浓度 C、光照与温度光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。,再分化时，可经过两条途径 1、器官发生途径2、体细胞胚胎发生途径,1、器官发生途径,植物的离体器官的发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有四种方式： A: 先芽后根；如小麦，芦荟、苹果 B: 先根后芽；如枸杞、苜蓿C:在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏 D:仅有根或芽再生，形成无芽的根或无根的芽。,器官分化的过程:愈伤组织
7、再分化器官一般要经过三个生长阶段1.外植体经过诱导形成愈伤组织。2.生长中心的形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。3.器官原基及器官形成。生长中心形成后，按照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官。,愈伤组织分化不定芽,愈伤组织分化期,2、体细胞胚胎发生途径,胚状体发生途径形成植株的特征1、具有两极性 细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单向极性。2、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而
8、不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系3、胚状体的维管组织的分布是独立的“”形，而不定芽和不定根的维管组织无此现象。4、发育过程与合子胚相似。并具有与合子胚类似的形态结构，可独立萌发形成小苗。,2.4 植物组培的实验条件,准备室：进行一切与实验有关的准备工作：器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等要求：20平方米左右。要求宽敞明亮设备：清洗区，干燥箱，工作台，水箱，天平，灭菌锅等。 无菌操作室： 也叫接种室，进行材料的立体无菌操作，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。要求：10-20平方米即可，封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌.设备：超净工作
9、台，紫外灯和空调,培养室： 对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养要求：约需10-20平方米左右。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，设备：培养架、光照培养箱或人工气候箱、温湿度计、空调等。缓冲间：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。要求：缓冲间需3-5平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。设备：1-2盏紫外灯、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。,基本实验
10、室 准备室,培养室,2.5 植物组织培养步骤,植物组织培养两个步骤：1、植物细胞或组织脱分化，形成愈伤组织。2、愈伤组织形成分生细胞团，再分化成不同的器官。 有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官 到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培养基，尤其培养基中添加激素的种类、浓度及配比,1、培养材料的采集选择具全能性细胞：受精卵、分生组织细胞、雌雄配子及单倍体细胞常用植物茎尖、下胚轴、幼叶作为外植体。考虑因素：材料的来源、外植体年龄、产地、外植体的大小、形状、生理部位。,（1）最常用的组培材料： 茎尖、茎段、皮层、表皮、维管组织、块茎、花瓣、根、叶、子叶
11、、胚珠、花药等。 茎尖：形态已建成，繁殖率高，不易产生变异。茎尖最先端为无病毒区。通常为0.5cm，无病毒区为0.1mm。 缺点：数量少，取材有限。 茎段：一般为0.51cm长，取材方便。 缺点：所获得的愈伤组织来源不一，有异质性，再生植株易产生变异。, 叶：取材方便，再生能力强 。 花器官：取材包括花托、花瓣、花药、子房等。 种子（果实）：无菌种子发芽后可作外植体。子叶和下胚轴也可培养。,2、培养材料消毒A:自来水冲洗、蒸馏水冲洗、无菌滤纸吸干。B:无菌操作将材料放入70%酒精浸泡30-60sC:将材料移入Naclo饱和液或0.01%升汞消毒8-10min。D:取出无菌水冲洗。,3、制备外植
12、体：用消毒过的器械无菌操作将外植体置于培养皿上。 切取外植体为适当大小，一般0.2-0.5cm。 4、接种和培养诱导培养基成分一般为基本培养基+细胞分裂素+生长素+附加成分, 基本培养基一般选择MS配方（1）接种：每瓶约410个 （2）封口 （3）培养条件：温度为25+2 光照为10004000lx pH值常为5.66.0 培养室的相对湿度要常保持在7080%。,5、增殖 把在诱导培养基上分化出的幼芽继代培养。 转到增殖培养基上进行培养, 这是使幼芽快速增殖的关键环节。6、根的诱导 继代培养的不定芽或侧芽需要生根培养，在生根培养基中培养一个月左右方可获得根系。 7、组培苗的练苗移栽,炼苗与移栽
13、,切取,2.6 愈伤组织形成的过程,外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期诱导期分裂期形成期,1、诱导期：细胞分裂的准备期 诱导期是细胞准备进行分裂，需加入诱导剂或细胞分裂素。2、分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期 。分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。,3、分化期：从愈伤组织到器官发生 。其间受很多因素影响。,愈伤组织的形态,愈伤组织的颜色,愈伤组织的种类 1、胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。 胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。 2、非
14、胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。,复 习,愈伤组织再分化经历两个途径：器官发生方式再生植株的三种 途径： 可能先长芽后长根（常见）。 形成根，根上再长出芽（少见）。 在愈伤组织不同部位分别形成根和芽。,胚状体形成途径 胚状体：指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构。 体细胞胚与合子胚发育过程相似： 原胚 球形胚 心形胚 鱼雷形胚 子叶型胚,胚状体发生途径,外 植 体 高浓度生长素（2,4-D） 脱 分 化 愈伤组织 高（细胞分裂素/生长素） 再 分 化 形 成 芽 低（细胞分裂素/生长素） 分 化 根 完整植株,激素控制器官分化模式图,植物组织培养举例
15、,一、材料和培养基l0-l5cm高的芦荟幼苗;愈伤组织诱导培养基为MS+(1一6mg/ L)BA+(0.1一0.5mg/L)NAA;分化培养基为MS+(2-4mg/L)BA+ (0.1-0.5mg/L)NAA;生根培养基为MS+(0.1一0.5mg/L)IBA+(2一5mg/L)PP33。,二、繁殖方法 (一)愈伤组织培养 将准备好的芦荟幼苗在清水中冲洗数次，剪去叶片和大部分茎段，取茎尖部分，再冲洗1-2次，淋干。在超净台上，先用75%的乙醇将茎尖浸泡30-60s，再用升汞浸5-l0min，最后用无菌水冲洗数次。用解剖刀取出包括茎尖生长点的组织切块，接种到愈伤组织诱导培养基上。大约15-25d
16、后，试管中接种的外植体就可以膨大，形成愈伤组织。愈伤组织的形成标志着接种的外植体的生长状态已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。愈伤组织形成1周后，就可将愈伤组织转管进行继代培养或分化培养。(二)继代培养 将愈伤组织在无菌条件下，用解剖刀将愈伤块切成数个小块，再接种到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，在与诱导愈伤组织相同的培养条件下继续培养。几天后，小愈伤块即可逐渐长大，这一过程称作继代培养。通过愈伤组织的继代培养，原来接种的1个芦荟茎尖组织可繁殖出大量的新接种材料来，用于分化培养。,(三)分化培养 将愈伤组织在无菌条件下，从试管或三角瓶中取出，用无菌水洗净，切成小接种块，接种到装有分化培养基
17、的三角瓶中，分化培养的条件同愈伤组织培养。大约30-50d后，愈伤组织就可分化出芽，并继续长出小叶片。当分化出的幼苗长到一定高度或分化出一定数量后，将这些小幼苗在无菌条件下取出，进行生根培养或重新诱导分化。(四)生根培养 当三角瓶中的幼苗叶片长到3cm左右时，将幼苗在无菌条件下取出，放入装有生根培养基的三角瓶中培养，培养条件同分化培养。大约半个月后，幼苗即可生根。(五)炼苗 当幼苗的根长到一 定长度，幼苗形体已显健壮时。将幼苗取出，在清水中洗除附着在根上的培养基(注意:一定要严格洗净，否则会烂根)。(六)移栽 炼苗后，将幼苗移栽入由蛭石组成的驯化苗圃中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，
18、大约15-20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。,1、在植物育种上的应用 突变育种：无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界压力的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。原生质体融合和细胞杂交：可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或育成优良品种。单倍体育种：利用花药培养诱导花粉形成单倍体，在试管培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，而成为纯合二倍体植物，从而缩短新品种育种的时间，还有利于突变中隐性突变的分离。,2.7 植物组织培养的应用,2、在植物脱毒和快速繁殖上的应用植物脱毒和离体快速繁殖是目前植物组织
19、培养应用最多、最有效的一个方面。很多农用物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，但是，患病植株并非每个部位都带有病毒，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒苗，再用脱毒苗进行繁殖，则种植的作物就不会或极少发生病毒。,马铃薯脱病毒试管苗,由于组织培养法繁殖作物的突出特点是快速，因此，对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”作物品种的繁殖，意义更大。对于脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖，同时可不受地区、气候的影响，比常规方法快数万倍到数百万倍的速度扩大繁殖，及时提供大量优质种薯和种苗。,3
20、、在植物种质资源保存和交换上的应用 由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类活动对大自然的影响，已有相当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。具有独特遗传性状的生物物种的绝迹是一种不可挽回的损失。利用植物组织和细胞法低温保存种质，给保存和抢救有用基因带来了希望。例如胡萝卜和烟草等植物的细胞悬浮物，在-20至-196的低温下贮藏数月，尚能恢复生长，再生成植株。,2.8 人工种子,2.8.1 人工种子理论基础胚状体： 是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构，又称体细胞胚。 A: 体细胞胚胎发生特点1、是离体培养的产物2、起源于非合子细胞3、发育过程与合子胚相似，也经历球形
21、期、心形期、 鱼雷期和子叶期阶段。,B: 体细胞胚胎发生途径 胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种：,直接从器官外植体上发生愈伤组织发生悬浮培养细胞发生单倍体细胞发生原生质体发生,2.8.2 人工种子概念,利用人工种皮包被体细胞胚可以制造人工种子。 人工种子的结构农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、胚乳和胚三部分构成。 目前研制的人工种子的结构: 体细胞胚 人工种皮 人工胚乳,2.8.3 人工种子的基本制作流程 外植体的选择和消毒 愈伤组织的诱导体细胞胚的诱导 体细胞胚的同步化体细胞胚的分选体细胞胚的包裹(人工胚乳)包裹外膜发芽成苗试验体细胞胚变异程度与农艺研究
22、。,人工种子制作过程中，包埋是最重要环节包括包埋介质的选择，主要是人工胚乳和人工种皮的选择人工胚乳一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成,养分包括矿质元素、维生素、碳源以及激素等,对于人工胚乳包埋介质的要求： 首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。 同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。 此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。海藻酸钠作包埋剂,2.8.4 人工种子优点：第一，它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具有省
23、地省工可直接在田间播种等优点。第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，这是微繁殖难以达到的。第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。,2.9 植物细胞培养,2.9.1 概念：离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养。得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖。从而获得大量细胞群体的一种技术。方法：根据对象：单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养。按培养系统：悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养图
24、3-7,2.9.2 植物单细胞培养,1、单细胞制备方法由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞A: 机械法：通过机械磨碎、切割植物体获得游离单细胞。B: 酶解法：采用水解酶去除细胞壁，释放出细胞，用来制备原生质体。叶片是分离单细胞的最好材料,机械法,Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞,C: 愈伤组织诱导法：先获得愈伤组织，在通过震荡获得单个细胞步骤：(1) 诱导产生愈伤组织； (2) 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。(3)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物。,2、单细胞培养方法,A: 平板培养法概念：将制备好的单细胞
25、悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养1、单细胞悬浮液的制备 2、悬浮细胞密度的调制3、琼脂培养基的配制4、平板制作 5、培养,主要技术要点：单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为103或105个细胞/ml,植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，将培养皿封严以防污染.在25黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。,特点：单
26、细胞在培养集中分布均匀，便于显微镜下定点观察；培养细胞气体交换不畅。,平板培养法,B: 看护培养法 用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。（1）取处于活跃生长期约1厘米大小愈伤组织块。（2）无菌条件下，愈伤组织块安放在培养瓶中，在愈伤组织上放约1厘米平方的无菌滤纸片。置培养室中放过夜。（3）将分离出的单细胞接种在培养瓶中的滤纸上面。（4）恒温培养。,特点：（1）效果好，易于成功。（2）简便易行。（3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。,C: 微室培养法 人工制造一个小室（载玻片和盖玻片），将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。小室可通过
27、毛细管与外界通气，便于观察。,微室培养,1滴含单细胞培养液,周围加石蜡油,凹穴载玻片,旁边加石蜡油,盖盖玻片,盖盖玻片,置培养皿中2628 恒温培养,特点：在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。,D: 其它单细胞培养技术饲养层培养基技术 是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。双层滤纸植板培养方法,培养基,饲养层细胞,看护滤纸层,转移碟滤纸,培养细胞,E: 悬浮培养悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培
28、养基中进行培养增殖的技术。1、起始培养物的建立选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。2、选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强,悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一、增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；可以适当改善气体的交换二、在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三、适合大规模培养。生产有价值次生代谢产物。,3、建立细胞悬浮系,一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬
29、浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,104,4、悬浮培养中细胞生长量的计算,细胞计数细胞密实体积（PCV）,5铬酸或0.25果胶酶使悬浮细胞团分散用血球计数板进行。,将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，2000转下离心，用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示,细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽虑，称重。细胞干重离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在60烘12h，在干燥器中冷却后称重,5、悬浮细胞培
30、养的同步化,细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。1、物理方法1）分选法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中 。2）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度,2、化学方法1）饥饿法 悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。 常用
31、的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜,植物细胞培养的意义,2.10植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 李时珍（1593）在本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。,许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。例如：从胡萝卜、万寿菊提取色素从黄菊提取芳香油栀子提取果酸：果酸含有大量的维生
32、素，如维生素C、柠檬酸等。主要用作食品的调味剂，化妆行业用于制作护肤品和洗发香波等，美容院用作换肤液,2.11 植物细胞生物反应器大规模培养,目前采用液体培养基的悬浮培养1、植物细胞培养的特性a 植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；b 培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；c 细胞生长的中期及对数期易凝聚为团块，悬浮培养较难；d 培养时需供氧，培养液粘度大：e 具有群体效应；f 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；g 细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；h 悬浮培养中要求有一定的细胞
33、浓度，否则不生长。,2植物细胞培养液的流变特性 易结团，易分泌粘性物质。传氧速率降低，影响细胞生长。 3植物细胞培养过程中的气体传递与影响 （1）氧的传递 （2）CO2的影响,4泡沫与器壁表面黏附性 易产生泡沫，与器壁表面黏附性强，影响细胞生长，要尽量消除。 5细胞分裂和愈伤组织的形成 35天:发生细胞分裂 两周后:愈伤组织的形成 将其转移至分化培养基上即可最终获得试管苗。,2、液体悬浮培养理论基础-细胞生长曲线,在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线,滞后期,对数生长期,直线生长期,缓慢期,静止期,1,2,3,4,5
34、,3、悬浮细胞增殖各个时期的特点：,缓慢期,滞后期（延迟期）,细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关,对数生长期,细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变,直线生长期,细胞生长和发育最明显的时期,生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少,静止期,生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。,4、大规模细胞培养过程： （1）细胞的筛选与细胞株的建立（固液培养相结合）筛选细胞株的方法是：（1）愈伤组织的诱导与培养：将切取得材料放在培养基上，愈伤组织形成后，继代培养。（2）单细胞分离：挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织转移到液体培养基中震荡培
35、养，也可加入果胶酶，游离出单个细胞或小细胞团。（3）无性系的分离：将悬浮培养物经过不锈钢网过滤除去细胞块，浓缩后接种与固体培养基上培养2周。（4）细胞株筛选：在平板上选择生长迅速分散好的胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。（2）扩大培养将优良细胞株多次扩大繁殖得到大量细胞，用作生物反应器的种子,(3)生物反应器培养培养方式（一）分批培养/成批培养是指细胞接种到一定容积培养基的密封系统中培养， 它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。 特点：（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的养分为
36、细胞耗尽为止。（2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在培养基中的均匀分布。（3）培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长。（4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。,最佳继代时期： 了解细胞数目增长变化S形曲线后，选择对数生长期和直线 生长期！,（二）连续培养连续培养反应器，在投料和接种培养后，以一定速度连续采集细胞与培养液，以同样速度供给新鲜培养基，此种培养方式可使细胞生长环境长期维持稳定,封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。开放式连续培养
37、：系统中的细胞密度保持恒定。,连续培养,加入培养基,排出培养基及其培养物,二者体积相等,分：开放式连续培养（Open C.C） 封闭式连续培养（Closed C.C）,开放式和封闭式区别封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加；开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持恒定；通过调节流入和流出的速度，使培养物的生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上。,（三）半连续培养 在反应器中培养，一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换或添加某种营养成分的培养。 能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生物研究之用。,5.植物
38、细胞生物反应器大规模培养-生物反应器类型机械搅拌式、鼓泡式和气升循环式机械搅拌式：优点：搅拌均匀。缺点：剪切力大。气动式培养系统：优点：剪切力小缺点：操作弹性小，低气速或培养后期混合效果差；此时如果提高通气量又会产生大量泡沫。,机械搅拌式生物反应器,气动式生物反应器,6. 植物细胞生物反应器大规模培养-培养细胞和次生代谢产物生产的影响因素（1）细胞遗传特性 分清代谢物的合成部位或贮藏部位。（2）培养的环境条件包括光照、温度、通气、培养基成分、PH、调节因子等培养基成分：培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。 通气：KLa
39、（体积氧传递系数，单位时间、单位体积氧量）：如在15L的通风式反应器中培养的烟草细胞，当 KLa值在510h-1的范围内，随着 KLa的增加，生物量和代谢产物也呈线性增加 激发子:植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。,有用次生代谢物质,（3）培养方法(两阶段培养工艺）为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不同的培养基，即两阶段培养,两阶段培养方法：一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。 两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行
40、，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。,植物细胞生物反应器培养存在的主要问题 （1）搅拌或通气对细胞有损伤，泡沫产生、有益气体散失对细胞代谢不利。 （2）培养液粘度增加，影响细胞吸收营养及气体传递。 （3）反应器结构有缺陷。 （4）相关代谢机制不清楚。,2.12 植物细胞两相培养技术为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术。两相培养技术：在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，是培养体系形成上下两相，细胞在水相上生长，合成的次生代谢物质分泌出后转移至有机
41、相中。,优点： 减少产物反馈抑制 提高产物产量 实现培养连续性,2.13 生物反应器固定化培养固定化培养：是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中、培养液成流动状态进行无菌培养的一门技术。,* 细胞固定化具有以下意义： （1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。 （2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。 （3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。 （4）有利于进行连续培养和生物转化。,细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类： 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐b、聚丙烯酰胺等； 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。固定化
42、方法：滴入CaCl2使海藻酸盐形成颗粒,固定化培养反应器： 流化床生物反应器： 细胞包裹在胶粒、金属或泡沫颗粒中。 优点：细胞包埋颗粒小，传质效率高。 缺点：剪切力或碰撞破坏细胞。, 填充床生物反应器： 细胞固定在胶粒、金属或泡沫颗粒或连续多个网中，或位于支持物表面。细胞固定不动。 优点：单位体积容量大。 缺点：混合效率低、传质效率低，颗粒或碎片易阻塞液体流动，高温变形的固定材料易阻塞。 膜生物反应器 常用中空纤维和螺线式卷绕反应器。 缺点：传质效率低、易阻塞，产物收获较困难，投资大。,培养技术的选择包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为
43、理想的系统。,2.13 植物原生质体培养,2.13.1 原生质体概念及特点原生质体定义：去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。特点：1、无细胞壁障碍，可以方便的进行有关遗传操作2、具全能性，能人工培育发育成完整植株。3、适合进行诱导融合形成杂种细胞,用途： 1、原生质体没有细胞壁，有利于细胞融合，体细胞杂交，基因转移和单细胞培养。2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质，作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研究，,2.13.2 原生质体的分离与纯化 原生质体材料来源：叶片，花瓣，果实组织，子叶等，尤其是叶肉细胞及由各部分形成的培养细胞和悬浮细胞。分离方法：1、机械分离法 产生质壁分离释放原生质体2
44、、酶分离法收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有效。 分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂，以其所含的主要酶的作用分为 1、纤维素酶类 2 半纤维素酶类 3 果胶酶类 4 崩溃酶 5 蜗牛酶。,原生质体分离（以叶片为例） 取材消毒：酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。,酶解：1、两步分离法。用果胶酶离析植物组织，收集细胞，经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。2、一步分离法。一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对
45、材料进行一次性处理。,2.13.3 原生质体的收集纯化方法1、离心沉淀法镍丝网滤出液 置于离心管（离心2-3分钟，原生质体沉于离心管底部，残液碎屑悬浮于上清液） 弃去上清液 再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中（反复3次） 2、漂浮法根据原生质体来源不同，利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。,3、沉降法和漂浮法结合 将收集的原生质体低速离心，倾去上清，将沉降得到的原生质体重新悬浮于蔗糖纯化液中，离心，收集表面悬浮的原生质体。再将原生质体重新悬浮于洗涤液中，离心收集沉于底部的原生质体。重复操作,2.13.4 原生质体鉴定与活力测定一、原生质体鉴定1、低渗爆
46、破法：把原生质体放入低渗溶液中，显微镜下观察原生质体从低渗溶液中吸水涨破的过程。2、荧光染色法：用荧光增白剂溶液对原生质体染色，在荧光显微镜下观察，绿色显示纤维素的存在，红光是没纤维素的真正原生质体,二、活力测定 1、目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。如形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。 2、染色识别A: FDA法： FDA本身没荧光，进入细胞后被脂酶分解为具荧光的极性物，不能透过质膜，而是留在细胞内发光。B:其他染色方法,FDA法,2.13.5 原生质体培养方法1、液体浅层培养将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。一般直径3cm加1-1.5ml培养液，6cm加2-3ml,5-10天后开始原生质体分裂优点：操作简单，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害，易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：是原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步生长与发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。,
