1、药物残留检测的基本原理,王玉峰2013.04,药物残留 主要包括农药残留和兽药残留、真菌毒素。,农药残留 在农业生产中施用农药后一部分农药直接或间接残存于谷物、蔬菜、果品 、畜产品、水产品以及土壤和水体中的现象。如滴滴涕，毒死蜱，马拉硫磷等。,兽药残留 是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物。如氯霉素，克伦特罗，硝基呋喃等。,真菌毒素,黄曲霉素：B1、M1、B2、M2、G1、G2桔霉素：展青霉素：玉米赤霉类：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、-玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮,其它,孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫糖皮质激素：泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松
2、、氢化可的松、可的松、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松雌激素类：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚,兽药残留检测方法,酶联免疫法：各种试剂盒液质质联用仪：LC-MS/MS，三重四级杆质谱仪、杂合三重四级杆(QTRAP)试纸条：微流控芯片：微生物抑制法：高效液相色谱,第一部分 酶联免疫技术在药残检测和 病毒抗体检测中的应用,酶联免疫检测的原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反
3、应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。,优点：灵敏度高(ppb) 操作步骤易掌握；不足：有些试剂盒价格昂贵 易出现假阳性，导致实验反复,酶联免疫检测兽药残留的方法类型,三种必要的试剂： 固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。,实例1.瘦肉精，磺胺类药残-间接竞争ELISA法(北京勤邦) 在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，标品或样本中残留的克伦特罗和预包被抗原竞争抗克伦特罗的抗体
4、，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物克伦特罗负相关，根据标准曲线，得出克伦特罗残留量。,瘦肉精-间接竞争ELISA法,3,3，5,5-四甲基联苯胺(TMB),TMB 氧化产物,加硫酸终止液后,ELISA显色机理,实例2.氯霉素-直接竞争ELISA法(杭州迪恩) 标品或样品中的游离氯霉素与酶标记的氯霉素竞争结合酶标板微孔中固相化的抗氯霉素抗体，通过清洗洗掉未结合的酶标记氯霉素，通过添加底物显色。样品的吸光值与浓度成负相关，根据标准曲线，得出氯霉素的残留量。磺胺七合一直接竞争ELISA法(天津九鼎),酶联免疫检测兽药残留的方法类型,氯霉素-直接竞争ELISA法,酶联免疫检测兽药残
5、留的方法类型,实例3.硝基呋喃-间接竞争ELISA法(无锡同昕) ELISA原理类似于瘦肉精的检测，不同之处是硝基呋喃需要衍生。 硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，代谢物在组织中则能存留较长的一段时间，所以我们检测的实为硝基呋喃的代谢物。由于代谢物均为较小分子，属于半抗原，因此制备其抗体时，需要进行衍生后，免疫动物获得抗体(也有可能是单克隆抗体)。 此处的衍生试剂还没有确定是否和GB中的衍生化试剂类似？,硝基呋喃-间接竞争ELISA法,实例4.伪狂犬病病毒(PRV)直接竞争ELISA法 在酶标板微孔条上预包被PRV的抗原PRV gB，阳性对照或样本中的抗体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；
6、清洗微孔后加入酶标记的抗PRV gB的单克隆抗体，第二次孵育时酶标单抗和样本中的抗体竞争吸附微孔条中的抗原。再次清洗微孔后加入底物TMB显色，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与抗体浓度负相关。即免疫成功，产生了抗体，显色的OD630值小于阴性对照。抗典型性猪流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血清的检测均采用直接竞争ELISA法。,酶联免疫检测病毒抗体的方法类型,(PRV)疫苗直接竞争ELISA法,实例5.猪繁殖与呼吸道综合症(蓝耳病，PRRS/US)的间接ELISA法 在酶标板微孔条上预包被PRRS/US的抗原，阳性对照或样本中的抗体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记
7、的抗猪的二抗，第二次孵育时酶标二抗和抗原抗体复合物结合。再次清洗微孔后加入底物TMB显色，样本吸光值与抗体浓度正相关。即免疫成功，产生了抗体，显色的OD450值大于阴性对照。,酶联免疫检测病毒抗体的方法类型,PRRS/US疫苗的间接ELISA法,第二部分：液质质联用技术在药残检测中的应用,液质质联用技术,药物在体内经过肝肾等器官的代谢被转化后，经尿液和粪便排出体外，只有极少部分残留在肌肉组织，在肝脏和肾脏中的浓度较高，但总体浓度均在ppb级(g/kg=ng/mL)。痕量检测最常用的方式是酶联免疫试剂盒和液相-质谱/质谱联用技术。,液质质联用技术，顾名思义将液相色谱的高效分离和质谱的高灵敏度有机
8、结合，串联质谱更提高了检测结果的准确性。液质质联用是药残检测最常用的检测方法之一，在国标，欧盟和美国标准中被广泛采纳。,液质质联用仪简图,三重四级杆(Q1Q2Q3)工作原理,MS1(母离子选择),MS2(子离子选择),质量分析器工作原理,兽药残留,氯霉素类：氯霉素(0.1ppb)、甲砜霉素和氟苯尼考(1ppb)硝基呋喃：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮(0.5ppb)红霉素类：红霉素、替米考星、泰乐菌素、林可霉素、螺旋霉素、交沙霉素、 吉他霉素、克林霉素和竹桃霉素(1ppb)四环素类：土霉素、金霉素、四环素和强力霉素(5ppb)-受体激动剂：沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克伦特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗、溴代克伦特罗镇定剂：乙酰丙嗪、氯丙嗪、异丙嗪、丙酰丙嗪、甲苯噻嗪、地西泮喹诺酮类：伊诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星和司帕沙星磺胺类：磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑。青霉素类：头孢氨苄、头孢拉定、。硝基咪唑类：4-硝基咪唑、异丙硝唑、2-甲硝咪唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氯甲硝咪唑、地美硝唑、苯硝咪唑及代谢物羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑,瘦肉精的定量检测,谢谢大家！,
