1、细胞培养技术,蔺帅2013年4月,主要内容,细胞简介,细胞是生命活动的基本单位1665年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文Cella（小室）词.,细胞简介,细胞是生命活动的基本单位1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了“细胞学说”的基本原则 1、细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的 2、每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的“生命” 3、新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生,细胞培养技术平台,细胞的培养具体方法与步骤,细胞培养细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来自机体的组织经分散成
2、为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用原代培养传代培养,细胞的培养具体方法与步骤,原代培养 用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。,细胞的培养具体方法与步骤,传代培养 传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传
3、代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。,HEK293T和HEK293细胞,HEK293细胞简介,HEK293细胞在倒置显微镜下的形态,HEK293T和HEK293细胞,HEK293细胞简介HEK293细胞株是转染腺病毒E1A基因的人胚肾上皮细胞，由于容易转染且容易培养，常被用于转染试验。,HEK293T和HEK293细胞,瞬时转染 在瞬时转染中重组DNA导入感染性强的细胞系已获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的DNA不必整合进宿主染色体，当用大量的样品需要在短时间内分析时，尤其是在转然后的1-4天内收获细胞，所得的溶解产物用于检测目的
4、基因的表达，可以采用瞬时表达的方式。稳定转染 这种细胞系中转染的目的基因整合到宿主染色体DNA中并指导适量的目的蛋白的合成。一般来说转染细胞的效率要比瞬时转染的效率低1-2个数量级。,HEK293细胞,HEK293细胞生长条件完全培养基 10%的胎牛血清 DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺 4500mg/ml葡萄糖 ) 1%双抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin)375%CO2,无菌技术,制定好实验计划和操作程序（准备好实验过程中的一切用品）洗手和着装（75%酒精消毒）进入超净台中的所有物品均需消毒操作野消毒,细胞培养耗材,HEK293
5、细胞的传代,待细胞的融合率达到90%时进行传代。弃去旧细胞液 4遇冷的DPBS（不含Ca2+ 、Mg2+）4ml冲洗后弃液 加入0.05%（37 预温 ）胰酶消化 加入12ml完全培养基（37 预温 ）将细胞从细胞瓶底部冲下 1:4传代即取3ml细胞悬液加入有9ml完全培养基的新细胞瓶中 放入37、5%CO2继续培养,HEK293细胞的传代,加入0.05%胰酶消化,HEK293细胞的传代,HEK293细胞的冻存,随着传代的次数增加，293细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。原则：慢冻,H
6、EK293细胞的冻存,冻存前的准备DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下。0.05%的胰酶消化液：37预温。程序冻存盒（加250ml异丙醇）、二甲基亚砜(DMSO)、2ml细胞冻存管（标记细胞名称、代数、日期）、DPBS（不含钙镁）,HEK293细胞的冻存,冻存前的准备,HEK293细胞冻存步骤,配制细胞冻存液 取50ml无菌离心管，于超净台内，加入适量DMEM培养基(含10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置室温下待用。,HEK293细胞冻存步骤,取准备冻存的细胞，弃去培养基，以DPBS2-3ml洗细胞一次,加入0.5-1.0ml
7、 0.05%的胰酶消化,加入新鲜培养基10-12ml吹打成细胞悬液,收集细胞悬液至50ml无菌离心管，1000rpm，5min离心.弃上清，加入适量培养基,取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，DMSO最后浓度为10%,HEK293细胞冻存步骤,细胞浓度为15106cells/ml（细胞计数），分装于已标示完全之细胞冻存管中,将细胞冻存管放入程序冻存盒中（已加250ml异丙醇），置-80超低温冰箱,第二天将细胞放入液氮灌，并记录,HEK293细胞冻存步骤,细胞冻存的注意事项欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以小体积分装，
8、4避光保存低温损伤主要发生在0-60这一温度区内，这一温度范围内不宜过久,HEK293细胞的复苏,当细胞传代次数过多(超过50代)，细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏原则：快复,HEK293细胞的复苏,复苏前的准备DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下将水浴锅预热至37取新培养瓶（75cm2），标记细胞编号、时间，加入10ml DMEM培养基(37预热)，润湿底面,HEK293细胞复苏步骤,根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞,迅速投入已经预热至37 的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化,用酒精擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内
9、，有培养基的培养瓶,轻轻混匀，置37、5%CO2培养箱中培养,次日换液,细胞培养的常见问题与解决方案,一、细胞培养污染问题二、何时须更换培养基三、可否使用与原先培养条件不同之培养基四、细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO,细胞污染问题与解决方案,细胞污染细胞培养中最大的敌人污染包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞,细胞污染问题与解决方案,细胞污染的原因无菌操作技术不当操作室环境不佳培养基或者血清的污染,细胞污染问题与解决方案,细胞的细菌污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以。革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、假单胞菌等。
10、其中又以白色葡萄球菌较常见。细菌污染后，会很快出现培养液变混浊，pH改变。也有少数培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。,细胞污染问题与解决方案,细胞的细菌污染检测16S RNA PCR法,细胞污染问题与解决方案,常见的细菌污染,白色链球菌污染以及革兰氏染色图片,细胞污染问题与解决方案,细胞的真菌污染梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。,细胞污染问题与解决方案,细胞的真菌污染检测镜检有丝状物,细胞污染问题与解决方案,常见的真菌污染,真菌污染,霉菌污染,细胞
11、污染问题与解决方案,细胞的支原体污染细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题细胞被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。,细胞污染问题与解决方案,细胞的支原体污染检测 试剂盒检测法： 目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性,细胞污染问题与解决方案,常见的支原体污染,支原体污染的电镜下图片,细胞污染问题与解决方案,细胞污染的解决方法控制环境污染；严格实验操作原则上弃掉加抗生素 污染后清除用药需采
12、用大于常用量510倍的冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。,细胞污染问题与解决方案,细胞污染的解决方法加抗生素,细胞污染问题与解决方案,何时需更换细胞液视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可,细胞污染问题与解决方案,何时需更换细胞液视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可,细胞污染问题与解决方案,可否使用与原先培养条件不同之培养基不能，每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活,细胞污染问题与解决方案,细
13、胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。,细胞间的操作注意事项,未经许可，任何人不得进入细胞间。不得在细胞间内做任何与试验无关之事。不得携带任何与实验无关或可能导致污染的物品进入细胞间。必须随时保持细胞间的整洁、卫生，及时清理杂物、垃圾。所有设备、物品，使用后必须及时归位。进入细胞间必须更换细胞间专用拖鞋与工作服。不得将细胞间专用拖鞋与工作服传出细胞间外
14、。进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关闭状态。,,LOGO,细胞间的操作注意事项,操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、关闭风机。凡是带入操净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。使用倒置显微镜前，用75%酒精擦拭消毒载物台使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入放入培养箱中继续培养。,,LO
15、GO,细胞间的操作注意事项,每一个人操作结束后，必须及时清理操净工作台内的物品，不得在工作台内留置或堆积杂物。清理操净工作台后，用75%酒精擦拭消毒操净工作台面。每一个操作结束后，必须及使用84消毒液消毒管道，并清理废液瓶，及时弃去废液。操作结束后，确认倒置显微镜电源关闭。操作结束后，确认二氧化碳培养箱的两道门均处于关闭状态。离开细胞间前，确认空调已关闭（夏季高温季节除外）。每日最后一人离开细胞间前，打开紫外灯消毒。进入或离开细胞间时，注意观察二氧化碳钢瓶上的压力表压力是否正常（减压阀出气口的压力应在0.06-0.08Mpa之间）。注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。定期打扫细胞间：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、操净工作台等，然后用3苏尔或者新洁尔灭或者5%过氧乙酸擦拭,Thank You !,
