1、,色谱分离技术,开比努尔艾尔肯,概述,1,色谱分离分类,2,常用的色谱分离方法,3,发展与展望,4,内容 CONTENTS,色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。,色谱法(Chromatography)从二十世纪初发明以来，经历了整整一个世纪的发展到今天已经成为最重要的分离分析科学，广泛地应用于许多领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境保护，乃至空间探索等。 将一滴含有混
2、合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个同心圆环出现，这种层析现象虽然古人就已有初步认识并有一些简单的应用，但真正首先认识到这种层析现象在分离分析方面具有重大价值的是俄国植物学家Tswett。, 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小时至几天。,20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。
3、,1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC)特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。, 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。,1色谱法的特点： 与经典的分离提纯手段（重结晶，升华，萃取和蒸馏等）相比，色谱法具有快速，简便和高效率等优点。并能对复杂化合物，甚至立体异构体进行分离。 液相色谱（含柱，薄层色谱）适合于固体物质和具有高蒸汽压
4、的油状物的分离，不适合低沸点液体的分离。 气相色谱适合于容易挥发物质的分离。,2色谱法的优点（1）分离效率高。（2）应用范围广。（3）分析速度快。（4）样品用量少。（5）灵敏度高。（6）分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪器联用（7）易于自动化，可在工业流程中使用。,色谱法分类,色谱法分类,2.根据操作压力的不同分类 低压色谱 0.5MPa 中压色谱 0.55MPa 高压色谱 5 50MPa,3.按操作形式：柱色谱 分离体系采用圆柱管纸上色谱固定相是滤纸或将固定相载于纸上薄层色谱固定相是一层吸附剂物料，平铺于惰性平板上凝胶色谱,色谱法分类,1）在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称
5、为展开2）洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液3） 展开后各组分的分布情况称为色谱,色谱分离的基本原理,已广泛应用：反应过程的监控和跟踪混合物的分离无机，有机化合物的分离化合物原料，产物的鉴定纯度的检验,色谱法应用,柱色谱（column chromatography ）一，柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机
6、械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。,常用的色谱分离方法,柱色谱装置般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等部分构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。(一)进样及流动相供给装置 在制备型和工业型高效液相色谱中，流动相供给部分一般包括贮液罐、高压泵、液体混合室及梯度洗脱系统。,二、装置,薄层色谱法（thin-layer chromatography, TLC)是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一
7、端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。,薄层色谱法,1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸。气相色谱的出现使色谱技术从最初的定性分离手段进一步演化为具有分离功能的定量测定手段，并且极大的刺激了色谱技术和理论的发展。相比于早期的液相色谱，以气体为流动相的色谱对设备的要求更高，这促进了色谱技术的机械化、标准化和自动化；气相色谱需要特殊和更灵敏的检测装置，这促进了检测器的开发；而
8、气相色谱的标准化又使得色谱学理论得以形成色谱学理论中有着重要地位的塔板理论和Van Deemter方程，以及保留时间、保留指数、峰宽等概念都是在研究气相色谱行为的过程中形成的 。 气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。,气相色谱,气相色谱议,气相色谱议,高效液相色谱 （HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱
9、一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。,高效液相色谱,高效液相色谱仪,高效液相色谱仪,高效液相色谱(HPLC)流程示意图,离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是NH2，及MH3+ ：阳离子交换
10、剂的功能团主要是SO3H及COOH。其中-NH3+离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。,离子交换色谱,凝胶色谱分离具有许多特点： (1)凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好； (2)、应用范围广，分离分子量的覆盖面大，可分离从几百到数百万分子量的分子； (3)
11、设备简单，易于操作，周期短，层析剂不需再生即可反复使用，有的可连续使用几百次至上千次。,这些优点使凝胶色谱分离已成为一种通用的分离方法，在生物大分子物质的制备与生产技术中被广泛应用。,凝胶色谱分离,凝胶色谱分离,首先必须尽可能多的了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在2002000的化合物，可用液一固吸附、液一派分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000的，则可用空间排阻色谱法。二、溶解废 水溶性样品最好用离子交换色谱法，
12、或液液分配色谱法。微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性混合物，可用液一固色谱法。 三、化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螫合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液一液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液一液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。,要正确地选择色谱分离方法,新固定相的研究固定相和流动相是色谱法的主角，新固定相的研究不断扩展着色谱法的应用领域，如手性固定相使色谱法能够分离和测定
13、手性化合物；反相固定相没有死吸附，可以简单地分离和测定血浆等生物药品。 检测方法的研究检测方法也是色谱学研究的热点之一，人们不断更新检测器的灵敏度，使色谱分析能够更灵敏地进行分析。人们还将其他光谱的技术引入色谱，如进行色谱质谱连用、色谱红外光谱连用、色谱紫外连用等，在分离化合物的同时即行测定化合物的结构。色谱检测器的发展还伴随着数据处理技术的发展，检测获得的数据随即进行计算处理，使试验者获得更多信息。,色谱法发展方向,色谱新方法也是色谱研究热点之一。高效毛细管电泳法是目前研究最多的色谱新方法，这种方法没有流动相和固定相的区分，而是依靠外加电场的驱动令带电离子在毛细管中沿电场方向移动，由于离子的
14、带电状况、质量、形态等的差异使不同离子相互分离。高效毛细管电泳法没有HPLC方法中存在的传质阻抗、涡流扩散等降低柱效的因素，纵向扩散也因为毛细管壁的双电层的存在而受到抑制，因而能够达到很高的理论塔板数，有极好的分离效果。,色谱新方法,专家系统是色谱学与信息技术结合的产物，由于应用色谱法进行分析要根据研究内容选择不同的流动相、固定相、预处理方法以及其他条件，因此需要大量的实践经验，色谱专家系统是模拟色谱专家的思维方式为色谱使用者提供帮助的程序，专家系统的知识库中存储了大量色谱专家的实践经验，可以为使用者提供关于色谱柱系统选择、样品处理方式、色谱分离条件选择、定性和定量结果解析等帮助。,专家系统,
15、色谱分离技术的迅速发展，使得色谱分离在实践中从分析规模发展到制备规模和生产规模。在生产过程中，为迎接产品成本，质量标准方面的商业竞争及环境保护压力的挑战，必须进行色谱生产过程方法和操作最佳化方面的探索。在实验室工艺的放大和色谱技术的改进中，目前很大一部分研究工作致力于探索特别适合于大规模连续操作的具体高吸脱附，直接出来含固体颗粒料液能力，低返混性能和连续操作性能等特性的特殊色谱技术，并已开发出许多具备以上各类特性的不同色谱新技术，以适合不同的生产工艺需求。,展望,色谱技术在制备和工业规模上的发展目前仍处于相对早期，每种色谱技术都具有不同的优缺点和特性，因此发展能直接处理含固体物料，吸脱附性能高
16、，能警醒大规模生产等综合特性的连续操作色谱技术一直是人们所期望的。在色谱柱型方面，目前普遍采用的是经典的色谱柱，而毛细管柱非常适合于痕量分析，且fenix速度快，样品消耗少，是未来色谱柱型发展方向之一。,展望,样品所含组分的最少个数； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面积）； 分离效能（保留值及区域宽度）； 两相选择的依据（峰间距离）,从色谱流出曲线中可以得出许多重要信息：,思考题,答：1）在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为展开2）洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液3） 展开后各组分的分布情况称为色谱,1. 色谱分离的原理是什么？,答：1）相对分子质量 对于相对分子质量较低（
17、一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在2002000的化合物，可用液一固吸附、液一派分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000的，则可用空间排阻色谱法。 2）溶解废 水溶性样品最好用离子交换色谱法，或液液分配色谱法。微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性混合物，可用液一固色谱法。 3）化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螫合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液一液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液一液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。,2。选择色谱分离方法的主要根据是什么？,
