1、1,第五章 动物检验检疫技术,第一节 检验检疫样品第二节 细菌分离及鉴定第三节 病毒分离及鉴定第四节 其他病毒微生物分离及鉴定第五节 寄生虫检查第六节 现代生物技术在动物检验检疫中的应用,2,第一节 检验检疫样品,一、病料采集和运送1、在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出初步诊断;2、采取病料所用的容器、手术器械均应灭菌后才能使用,采样时应无菌操作;3、解剖前检查(只有在确定不是炭疽后,方可剖解);4、取材时间要早(死后6h内);5、应根据不同的疫病相应的采取脏器或内容物;若无法估计是某种疫病,可全面的采取。(脓汁、血液、皮肤、骨头、脑、脊髓等),3,二、病料的保存,(一)细菌检验材
2、料的保存脏器组织块保存于饱和氯化钠溶液或30%甘油缓冲盐溶液中容器加塞封固。液体装地封闭的毛细玻管或试管运送。生前由直肠中采集的粪团装入灭菌容器中寄送。(二)病毒检验材料的保存脏器组织块保存于50%甘油缓冲盐溶液或鸡蛋生理盐水中容器加塞封固。(三)病理组织学检验材料的保存脏器组织块放入10%福尔马林溶液或95%酒精中固定,固定液用量应为病料的10倍。,4,三、病料的记录、包装和运送方法,(一)送检单填写3份,一份存根,两份寄送检验室;待检查完毕后退回1份。(二)病料的包装和运送液体病料(如黏液、渗出液、尿及胆汁等)装入细玻璃管中(管口用火焰封闭)再用废纸或棉花包囊装入较大的试管中再装入木盒中运
3、送。组织块或脏器,5,第二节 细菌分离及鉴定,细菌分离及鉴定是用人工的方法使细菌在适当的环境和营养基质中生长繁殖,获取纯种、进行鉴定与研究等。为达到细菌分离及鉴定的目的,运用无菌技术提供适当的培养基适宜的培养方法和条件,6,六、细菌的分离接种平板划线接种法斜面接种法倾注培养法穿刺培养法半固体培养法液体培养法平板涂布培养法七、细菌的培养方法需氧培养法二氧化碳培养法(CO2孵箱法、烛缸法、化学法)厌氧培养法(厌氧罐培养法、培养箱法),7,八、细菌的鉴定,(一)细菌的生长现象观察,8,细菌的一些培养特征,有小刺,在琼脂穿刺培养中的生长,绒毛状,假根状,树状,念珠状,有小刺,念珠状,假根状,树状,扩展
4、状,丝状,丝状,在琼脂划线培养上的生长,量杯状,漏斗状,囊状,层状,萝卜状,在明胶穿刺培养中的生长,絮状,环状,膜状,肉汤表面生长,浮膜状,9,(二)、细菌基本形态及特殊结构的观察,细菌基本形态的观察细菌基本形态:球状、杆状和螺旋状。细菌基本结构:细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。细菌特殊结构:鞭毛、芽孢、荚膜等。均需染色方可在显微镜下观察,染色方法有:简单染色法:只用一种染料进行染色。复杂染色法:革兰氏染色法抗酸染色法(抗酸菌呈红色,非抗酸菌呈蓝色)瑞特氏染色法(细胞核呈蓝色,细胞浆呈红色)姬姆萨氏染色法(细胞核呈蓝色,细胞浆呈红色),10,细菌特殊形态的观察,11,(三)生化试验,细菌的生化试
5、验是继形态学鉴定之后,又一重要鉴别依据。糖类分解试验吲哚(靛基质)试验淀粉水解试验V-P试验甲基红(M.R)试验柠檬酸盐利用试验凝固血清紫牛乳试验硫化氢试验硝酸盐还原试验尿素酶试验,12,(四)、细菌抗原检测及血清型鉴定 细菌抗原结构比较复杂,有存在于细胞壁的菌体抗原(O抗原,有运动性的细菌在菌体抗原之外还有鞭毛抗原(H抗原),具有不同种、型特异性。 血清型鉴定 首先要求鉴定的细菌必须纯净、新鲜,在适宜条件下培养,尽量减少伟代,以防发生变异。 其次有特异性强和效价高的已知标准血清(包括单克隆抗体)和标准菌株。(五)、细菌遗传物质检测目前比较成熟的遗传物质检测包括基因探针技术和PCR技术,13,
6、(六)、细菌毒力测定表示细菌毒力大小的单位有:最小致死量(MLD):能使特定的动物感染后,在一定时限内发生的最少活的细菌量或毒素量。半致死量(LD50):在一定的时限内能使半数实验动物感染后发生死亡所需的活的细菌或毒素量。,14,第三节 病毒分离及鉴定,检材的采集与送检、病料的处理标本采取的原则:1. 病毒标本的采取应尽早为好.2.由于大多数病毒对热不稳定,应该立即接种,如果不能及时接种或需保存,一般置50甘油盐水4或一20以下保存。,15,三、病毒的分离培养,一、动物接种培养二、病毒的鸡胚培养三、病毒的细胞培养,16,一、动物接种培养,动物接种是最原始的病毒培养方法。主要用于目前无法用细胞、
7、鸡胚培养的病毒。常用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、 家兔,有时也用猴、猿、猩猩等。接种时要根据病毒对动物,组织细胞等嗜性不同而选 择特定的部位,如鼻腔、皮内、皮下、腹腔、脑内、静脉等。小白鼠脑内接种法【材料】 1.脑炎病毒(小白鼠脑脊髓炎)悬液:脑组织先用无菌生理盐水洗去血液,再加100脱脂奶水研磨成10毫升悬液,离心沉淀30分钟,吸取上清液。 2.小白鼠:3周龄,体重68克。,17,【方法】,11毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升,去除注射器内的气泡。2取出小白鼠,左手将小白鼠固定,固定时用大拇指和食指握住小白鼠的头部,左手掌轻轻按住小白鼠的体部。3右手以棉签蘸以碘酒,消毒小白鼠的右
8、颊部皮毛4右手拿住注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向注入,进入颅腔,进针23毫米,不要插得太深,注射量为0.020.03毫升。5注射完毕,将用过的注射器煮沸消毒,动物一般在34天开始发病,食欲减退,活动迟纯、耸毛、振颤、慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。,18,二、病毒的鸡胚培养,19,三、病毒的细胞培养通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出,分散成单个细胞,给予必要的生长条件,模拟体内生长环境,使其在体外能继续生长繁殖,称为细胞培养。,病毒的细胞培养步骤:病料处理病毒分离、繁殖细胞病变(CPE)观察,20,四、分离病毒的鉴定,(一)病毒形态与结构的观察(二)病毒核酸类型的测定(三
9、)病毒对几种类脂的敏感试验(四)病毒对几种理化因素的抗性测定(五)血吸附和血吸附抑制试验(六)干扰素敏感试验(七)蚀斑形成单位测定(八)病毒毒力的测定(九)血凝试验和血凝抑制试验(十)中和试验(十一)血清学试验,21,(一)病毒形态与结构的观察,禽流感病毒,狂犬病病毒,22,(二)病毒核酸类型的测定,胸苷酸是病毒DNA合成的重要物质,它的卤素替代物的存在能抑制DNA的合成。【方法】:1、给已长满细胞单层6孔板1-4孔每2孔加病毒液3滴;2、置375%CO2培养箱中1h;3、取出细胞板,吸出培养液;4、给相应的孔加5ml含胸苷酸的类同物的维持液或不含胸苷酸的类同物维持液;5、将细胞培养板放回CO
10、2培养箱中,每天观察细胞病变(CPE)。,23,(三)病毒对几种类脂的敏感试验,病毒有无包膜,常用脂溶剂氯仿、乙醚或去氧胆酸钠来处理病毒,看脂溶剂对病毒有无灭活作用而证明病毒有无包膜。以氯仿敏感试验为例:1、将氯仿加于病毒悬液中,使最终浓度达5%,充分振荡后在4放置10min.2、悬液用2000r/min离心沉淀5min,使氯仿沉于管底。3、吸取上层液,做连续10倍稀释。每一稀释接种4管细胞培养,滴定组织细胞半数感染量(TCID50)。未经氯仿处理的病毒悬液做同样处理。4、氯仿处理的病毒悬液的感染力如比对照悬液低2.0log以上即可认为是敏感。,24,(四)病毒对几种理化因素的抗性测定,1、热
11、灭活试验 有些病毒对热敏感在50 30min被灭活。2、阳离子稳定试验高浓度二价离子如MgCl2能稳定某些病毒如肠道病毒等,使其在50 60min 不被灭活。另一些病毒如腺病毒等则增加对热的敏感性。3、酸敏感试验在pH3溶液中经30min能降低某些病毒的感染力如口蹄疫病毒,而对另一些病毒如猪水疱病毒等没有作用。,25,(五)血吸附和血吸附抑制试验,细胞培养被某些病毒感染后,不论有无细胞病变,能吸附一些动物的红细胞。能凝集红细胞的病毒,一般具有血吸附作用。也有些例外,如部分肠道病毒有血凝作用但无血吸附现象;相反非洲猪瘟病毒虽不显示血凝活性,但却有血吸附作用。,26,(六)干扰素敏感试验,干扰素是
12、具有高度生物活性的细胞产物,能促使细胞产生抗病毒蛋白,干扰病毒的增殖,减少细胞CPE产生。,27,(七)蚀斑形成单位测定,病毒蚀斑(又叫空斑)如同噬菌体的噬斑,一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做蚀斑是一种较精确地测定病毒感染力的方法。【方法】:1、将病毒各稀释度种入单层细胞瓶,吸附1小时后,在单层细胞上复以营养琼脂培养基,病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染邻近的细胞,形成“蚀斑”的退化细胞区。2、经中性红活细胞染料着色后,活细胞显红色,而蚀斑区细胞已退化不着色,形成不染色区域。3、凡是能在细胞培养物中产生细胞死亡破裂现象(CPE)的病毒都可采用蚀斑技术来分离和
13、测定。,28,(八)病毒毒力的测定,衡量病毒毒力(毒价)的单位过去多用最小致死量(MLD)。现多改用半数致死量(LD50)。用鸡胚测定时,毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(ELD50)。用细胞培养测定时,用组织细胞半数感染量(ELD50)。,29,(九)血凝试验和血凝抑制试验,某些病毒(A型流感病毒、鸡新城域病毒等)由于具有血凝素,可以使鸡或其他一些动物的红细胞发生凝集。如果在这些病毒悬液中先加入特异性的免疫血清,则病毒凝集红细胞的作用被抑制。红细胞凝集极凝集抑制试验常用于测定病毒的含量及病毒的鉴定等。,30,第四节 其他病原微生物分离及鉴定,一、螺旋体 螺旋体是一类菌体
14、细长、 柔软、弯曲呈螺旋状,能活泼运动的原核单细胞微生物。基本结构与细菌类似。从有疑似急性螺旋体病症状的动物的血液和乳液中分离到螺旋体是有诊断价值的。但从血液中分离有一定难度,因为菌血症和临床症状往往不是同时出现。(一)病料的采集与检查(暗视野)(二)分离培养(三)动物感染试验(四)血清学试验,31,二、立克次氏体,立克次氏体是介于细菌和病毒之间的一类微生物,除少数成员外,大多为严格的细胞寄生性微生物。革兰氏染色阴性。微生物学诊断:病原的分离鉴定和动物血清中特异性抗体的检测。有些立克次氏体如Q热立克次氏体,对人有很强的传染性。在进行有关活立克次氏体的操作实验时应有完善的隔离防护设施和条件。,3
15、2,三、支原体,支原体是能在无活细胞培养基中繁殖的最小微生物,它是一类无细胞壁,仅由三层薄膜组成的细胞膜,胞质内有颗粒状核糖体,双股DNA的原核细胞。菌体形态呈高度多形性,有球状、杆状、环状、丝状等。革兰氏染色阴性,但较难着色。姬母萨氏法染色良好,呈淡紫色。,支原体菌落,33,四、衣原体,衣原体是一类专性严格的细胞内寄生生活的微生物,不能在细菌培养基上生长繁殖;在光学显微镜下可以被观察到。衣原体属中与动物有病原关系的主要为鹦鹉衣原体,它可引起畜禽的多种疾病,要确诊其病原,需进行病原体的分离培养及对分离物作鉴定。最常用的分离培养方法有(1)鸡胚卵黄囊接种法(2)小鼠接种法(3)细胞培养法。,34
16、,第五节 寄生虫检查,一、虫卵检查法:虫卵漂浮法二、虫体检查法蠕虫的成虫检查法:生前主要用于绦虫病疹断,死后剖检。蠕虫的幼虫检查法:多用于非肠道寄生虫或通过虫卵不易鉴定的寄生虫三、免疫学检测方法免疫沉淀法免疫荧光技术免疫酶技术免疫凝集技术四、分子生物学检测方法,35,第六节 现代生物技术在动物检疫中的应用,在动物疫病诊断和检疫中,现代生物技术的应用主要体现在两方面:一是基于抗原抗体反应的免疫血清学技术;二是基于病原核酸检测分子生物学技术。,36,免疫血清学技术包括:,中和试验:分离的病毒用已知特异性免疫血清来中和。凝集试验沉淀试验补体结合试验免疫荧光抗体技术胶体金标记技术 禽流感新城疫病毒胶体金快速诊断试纸的使用免疫电镜技术等病原菌的检测毒素的检测药物残留的检测病毒的检测寄生虫的免疫学诊断,37,38,