1、第一章 微生物的利用,实验1 大肠杆菌的培养和分离,什么是微生物？,乳酸杆菌,黑曲霉,微生物：结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。,什么是培养基？,三角瓶,培养皿,试管,液体培养基：扩大培养，工业生产。固体培养基：分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏。,凝固剂：琼脂,培养基的配制,提供碳元素：主要是糖类,提供氮元素：蛋白胨、牛肉膏、尿素,维生素、氨基酸和含氮碱基,H2O，良好的溶剂,NaCl：维持一定的渗透压,LB 培养基的配制,LB固体培养基：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0.25g，氯化钠 0.5g，加水50 mL，琼脂 1g。调节pH 至7.6。,封口膜,菌落：单细菌的
2、克隆,菌落：在固体培养基上，由单个细菌繁殖而来的一个肉眼可见的具有特定形状的子细胞群体。,霉菌,大肠杆菌,菌落的作用：鉴定菌种的重要依据,菌落特征：菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。,大肠杆菌,大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。,怎样无菌操作？,高压蒸汽灭菌：培养皿、试管、三角瓶、枪头、玻璃三角刮刀、接种环、镊子。在121下灭菌15 min。,高压蒸汽灭菌锅,培养皿,三角瓶,玻璃三角刮刀,接种环,微量移液器,枪头,棉花塞、封口膜、牛皮纸或旧报纸、橡皮筋,不能用脱脂棉：易吸水，容易引起污染。,酒精灯和酒精棉球,灭菌：杀死所有微生物。消毒：杀死部分微生物（不包括芽孢和孢子）。,超净工作台
3、,打开紫外灯和过滤风，灭菌30 min。点燃酒精灯酒精棉擦拭桌面酒精棉球擦手。,酒精灯火焰附近旁进行,灼烧灭菌,防止杂菌污染,用细菌过滤器除菌：尿素加热会分解，用G6玻璃砂漏斗过滤。,什么是倒平板？,将灭菌后的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中，冷却凝固后制成的培养基。,Step1：培养基的配制和灭菌,将50 mL LB液体培养基、50 mL LB固体培养基和培养皿进行高压蒸汽灭菌。,无菌水,培养皿用牛皮纸包扎,Step2：倒平板,在酒精灯火焰旁将三角瓶中的固体培养基（冷却到60）倒入灭菌的培养皿中，置于水平放置上，并轻轻晃动，待凝固后形成平面。,超净台,Step3：接种后扩大培养,将斜面上培养的
4、大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中，使其在37摇床培养12 h 。,恒温摇床,Step4：平板划线分离,用接种环在培养大肠杆菌的三角瓶中蘸取菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线。将培养皿倒置，放在37 恒温箱中培养1224 h。,怎样在平板上划线？,1次,2次,3次,4次,连续划线法,分区划线法,原因：随着划线次数的增加，菌数越来越少，最终在划线的末端出现由一个细菌繁殖而来的单个菌落。,为什么通过划线分离可得到单菌落？,原因：既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。,恒温培养时培养皿倒置,培养皿倒置,皿盖,皿底,恒温培养箱,Step5：菌种的斜面保
5、存,将接种环将单菌落取出，用划线法接种在斜面培养基上，37培养24 h后，置于4冰箱中保存。,斜面培养基,试管斜面培养基的制作,方法：将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中，灭菌后将试管斜放，令其冷却，固体培养基即成为斜面。,平板划线分离法,灼烧接种环,外焰,先灼烧后冷却：以免接种环温度太高，杀死菌种。,接种环冷却后，蘸取带菌培养物,在近火焰处，让带菌接种环在固体培养 基上划线,恒温培养箱中倒置培养,分区划线法,每次划线之前都要灼烧接种环。总是从上一次划线的末端开始划线。,稀释涂布分离法,用无菌吸管吸取1mL细菌培养液加入另一个盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。,梯
6、度稀释菌液：10-510-7倍,滴加菌液,用无菌吸管取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。,用玻璃刮刀涂布,玻璃涂棒,将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待玻璃刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个培养基表面。,将培养皿倒置，在37恒温箱中培养2448 h。,恒温培养箱中培养,恒温培养箱,结果：以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,倒平板,平板划线分离,练一练，识一识,稀释涂布分离,接种环,玻璃刮刀,例题：要获得遗传特性单一的大肠杆菌菌种，一般必须对原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养，并利用纯化技术得到单菌落的菌种
7、。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实验的相关问题：（1）对买回来的大肠杆菌菌种进行扩大培养，一般用LB培养基，在培养基中为微生物提供碳源、氮源和能源的物质主要是，为调节渗透压，要加入一定量的。为进行大肠杆菌的分离，还要加入 配制成固体培养基，并进行倒平板的操作。,蛋白胨和酵母提取物,氯化钠,琼脂,（2）获得纯净微生物培养物的关键是，为此，必须对培养器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培养器皿和培养基一般采用 法灭菌，接种环采用灼烧法灭菌。同时在接种或倒平板操作时，除了在超净台上进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和消毒外，还必须 以防止空气中的杂菌污染。（3）大肠杆菌菌种的扩大培养一般采用液体培养基，接种后将培养基置于37摇床振荡条件下培养12 h。菌种的分离一般在固体培养基上采用法，并将培养皿以状态放置于适宜温度的恒温箱中，培养1224 h后，接种于固体斜面培养基上，37培养24 h后，得到的纯化菌种在条件下保存。,防止被杂菌污染,高压蒸汽灭菌,保证操作过程在酒精灯火焰旁进行,划线分离,倒置,将单菌落用接种环取出,4,
