1、实验报告针对食醋样品的一系列微生物学实验陈立才生命学院 2004 级 生物科学专业 学号：20041401014同组：陈龙 黄彬摘要 暑假期间，我们对某食醋生产厂生产的食醋样品（受污染）进行了微生物的检测、鉴别及分离等实验。采用了梯度稀释、涂布平板、平板划线、液体培养等微生物学实验方法，检测到几种污染微生物的存在，并最终分离纯化得到了生产食醋的主要生产菌醋酸杆菌的纯培养物。关键词 醋酸杆菌 梯度稀释 涂布平板 培养 镜检 平板划线 一资料部分一 固体发酵法酿醋的工艺流程二 食醋酿造用微生物曲霉菌曲霉菌有丰富的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系，因此常用曲霉菌制糖化曲。酵母菌在食醋酿造过程中，淀粉质原
2、料经曲的糖化作用产生的葡萄糖，酵母菌则通过其酒化酶转系把葡萄糖转化为酒精和二氧化碳。醋酸菌醋酸菌具有氧化酒精产生醋酸的能力。醋酸是在酿制过程中继酒精生成之后由醋酸菌将酒精转化成的。常用和常见的醋酸菌有：奥尔兰醋酸杆菌（A.orleanense） 、许氏醋酸杆菌（A.schutzenbachii） 、恶臭醋酸杆菌（ A.rancens）等。二实验部分入缸 糖化、酒精发酵、倒醅 拌匀 醋酸发酵、倒醅 加盐后熟 淋醋 配制澄清 灭菌陈酿 成品醋酸菌种子 粗谷糠 食盐混合 润水 蒸熟 摊晾过筛 拌匀麸曲 酒母细谷糠甘薯干 粉碎一 样品来源某食醋生产厂的三个不同阶段的醋产品二 实验目的1 检验样品中是否
3、有杂菌污染2 分离获得醋酸杆菌的纯培养物三 实验原理醋酸菌的特性：1 菌体细胞形态醋酸菌是两端浑圆的杆状菌，单个或成链状排列，有鞭毛，无芽孢，属革兰氏阴性菌。2 对氧要求 醋酸菌为好氧菌，必须供给充足的氧气才能进行正常发酵。在含较高浓度乙醇和醋酸的环境中，醋酸杆菌对缺氧非常敏感，中断供氧会造成菌体死亡。3 对环境要求醋酸菌生长繁殖的适宜温度为 2833，醋酸菌不耐热，在 60下经 10min 即死亡。醋酸菌生长的最适 pH 为 3.56.5。醋酸杆菌对酒精的耐受力颇高，但对食盐的耐受力很差，当食盐浓度超过 1%1.5%时就停止活动。根据以上特征，可以采用微生物学实验方法分离、鉴别醋酸杆菌。四
4、培养基 牛肉膏蛋白胨固体培养基（含 2%的葡萄糖） ，牛肉膏蛋白胨液体培养基（含 2%的葡萄糖）五 仪器及其他用品 显微镜 平皿 微量加样器 离心管 酒精灯 接种环 玻璃涂棒 恒温箱 pH 计六实验操作 1 微生物的检验与分离 配制培养基 配置 250ml 牛肉高蛋白同培养基，加入 2%的葡萄糖，在 115下灭菌30min。 倒平皿 取灭菌的平皿 12 个，在无菌条件下，分别在每平皿中倒入约 20ml 培养基，待培养基凝固后置于 37的恒温箱中干燥 2 小时。 样品标号 给 3 个样品分别标号 A、B、C。 梯度稀释 取 9 支离心管，分别标号 A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3、
5、C-1、C-2、C-3。无菌下，分别对 3 个样品进行梯度稀释，得到稀释倍数分别为 10、100、1000 的稀释样品液，分别置于对应编号的离心管中。 涂布 取 9 个灭菌平板分别标号 A-1、A-2、A-3 、B-1、B-2、B-3、C-1、C-2、C-3。无菌条件下，用微量加样器分别吸取各稀释样品 100l 加入对应标号的平板中，用玻璃涂棒涂布均匀。另取三个平板，标号为 A-0、B-0、C-0 用于分别涂布三种样品的 100l 原液。注意将每将一个样品加入平板后应立即涂布。 培养 将上述平板置于 37的恒温箱中培养 22h。 培养结果 对各平板中各种菌落进行观察作下表（表）表：不同平板中个
6、不同菌落的特征及相似菌落的数目记录表 菌落特征样品平板菌号大小 形态 干湿 高度 透明 颜色 边缘菌落数 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 70A-0 小 圆形 湿 隆起 不透明 乳白 整齐 9 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 13A-1 小 圆形 湿 隆起 不透明 乳白 整齐 5A-2 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 2 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 120B-0 小 圆形 湿 隆起 不透明 乳白 整齐 10 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 21B-1 小 圆形 湿 隆起 不透明 乳白 整齐 9 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 1B-2 小 圆
7、形 湿 隆起 不透明 乳白 整齐 150 大 圆形 干 隆起 不透明 白 不整齐 7 中 圆形 干 隆起 不透明 乳白 不整齐 16C-0 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 17 大 圆形 干 隆起 不透明 白 不整齐 4 中 圆形 干 隆起 不透明 乳白 不整齐 2C-1 中 圆形 湿 隆起 半透明 乳白 整齐 7注：A-3 、B-3、 C-2、C-3 号平板中只有 1 个或无菌落，在此表中未做纪录。挑取培养结果平板中的不同种菌落的菌用结晶紫进行单染色，在显微镜（油镜）下进行细胞形态的观察，观察结果如下表（表） 。表：平板中各不同种菌的细胞形态观察结果记录表样品号 样品中微生物编号 平
8、板中微生物编号 细胞形态A- A-0- 、A-1-、A-2- 杆菌、无芽孢AA- A-0-、A-1- 球菌，无芽孢B- B-0-、B-1-、B-2- 杆菌、无芽孢BB- B-0-、B-1-、B-2- 球菌，无芽孢C- C-0-、C-1- 杆菌、有芽孢C- C-0-、C-1- 杆菌、无芽孢CC- C-0-、C-1- 杆菌、无芽孢 结果分析从表、表中数据分析：样品 A 中至少存在两种菌，一种是杆菌，一种是球菌，其中杆菌较多，占 2/3 以上。样品 B 中，一种是杆菌，一种是球菌，其中杆菌较多，占 2/3 以上。样品 C 中至少存在三种菌，均为杆菌，其中一种有芽孢，另两种无芽孢。由于 A-0、A-1
9、 、A-2 号平板来源与同一种样品，只是稀释度不同，A-0-、A-1-、A-2-号菌的菌落形态和细胞形态均相同，因此它们应为同一种菌，记为 A-；同样，其他也是这样，见表中编号。由此可得出结论：三种样品中均有杂菌污染根据醋酸菌的特征，可假定 A-、B-、C- 或 C-号菌为醋酸菌2 醋酸杆菌的鉴定 配置牛肉膏蛋白胨的培养基（含 2%葡萄糖） ，并倒 6 个平板。将假定为醋酸菌的 A-2-3、 号菌用接种环挑取在平叛上进行划线（见下图划线方法） ，在 37下培养 24h ,得到单菌落。图 1 平板划线方法 革兰氏染色实验 对上述菌进行革兰氏染色，并纪录结果。 代谢实验 培植牛肉膏蛋白胨液体培养基
10、，调节 pH 为 7。取 8 支试管每两个一组，分别标号 1、2、3、4,分别装入约占试管 1/4 的培养液，分别接入上述三个平板中单菌落的菌，另取一支试管，标号 5，装入约占试管 1/4 的培养液，不接任何菌作为空白对照。将四个试管放入摇床培养室中 37倾斜- 培养 24h 后取出，用 pH 计分别测四个试管的 pH，并纪录结果。 好氧性实验 分别挑取少量上述菌于载玻片上，用过氧化氢溶液滴加其上，看是否产生气泡，纪录结果。 实验结果表：革兰氏染色结果细菌 A- B- C- C-革兰氏阴（或阳）性 阴性 阴性 阳性 阴性表：代谢实验结果各培养液的 pH试管标号 1（A-）2（B-）3（C-）4（C-） 55.57 5.75 5.81 5.89 7.00pH5.65 5.81 5.73 5.54 表好氧性实验结果细菌 A- B- C- C-好氧性 好氧 好氧 好氧 好氧 结果分析由以上结果，可知 A-、B- 、C-号菌的上述特征均符合醋酸菌的特征， 由此可初步判定 A-、B- 、C- 号菌均为醋酸杆菌。3 醋酸菌纯培养及保藏将上述鉴定出来的醋酸菌采用平板划线方法培养，再次获得纯的单菌落，分别接入装有牛肉膏蛋白胨的固体培养基斜面的 3 支试管中，37培养 24h 后，放入冰箱 4下保藏菌种。参考资料：1 现代食品发酵技术 ，王福源主编，中国轻工业出版社。 指导教师签字：
