1、细菌性食物中毒的实验室支持,泉州市疾控中心 郑友限,食物中毒的概念,定义：国家标准(GBl4938)中界定了食物中毒， 指摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄入后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。 即食物中毒指通过饮料或食物及其盛具、容器、包装材料进入人体的某种致病性微生物及其毒素、有害有毒的化学物质(包括有毒动植物)等引起的，多数是以急性胃肠炎症状为主要特征的一群疾病。但不包括已知的传染病，寄生虫病、人畜共患性疾病、食物过敏和暴饮暴食所引起的急性胃肠炎等食源性疾病。,食物中毒的特点,食物中毒常呈集体性爆发，其种类很多，病因也很复杂，一般具有下
2、列共同特点： .潜伏期短，在短时间内可能有很多人同时发病。 .有相似的临床表现，病人都有大致相同的临床表现。 .与饮食有关，凡进食某种有毒食品的人大都发病，没有进食该种有毒食品的人不发病。发病和食物有明显关系，一旦停止食用这种有毒食品，发病立即停止。 .发病率高、爆发性，人与人不传染，一般没有传染病流行时的余波或拖尾现象。 (5).发病季节性强，一般多发于4-10月份，6-9月进入高峰期。,食物中毒分类,一般按病原物质，将食物中毒分为五类。.细菌性食物中毒：是指由于食入被病原菌或其有毒代谢产物污染的食物后，所引起的以急性肠胃炎为主要中毒症状的疾病。.真菌性食物中毒：指食入被真菌及其毒素污染的食
3、物而引起的食物中毒。 .动物性食物中毒：指摄入动物性有毒食品引起的食物中毒。 .植物性食物中毒：摄入植物性中毒食品引起的食物中毒。 .化学性食物中毒：摄入化学性有毒食品引起的食物中毒。,细菌性食物中毒,细菌性食物中毒：是指人们吃了大量活菌或活菌产的毒素养污染的食品所引起的种毒现象。细菌性食物中毒按发病机理又分为感染型食物中毒、毒素型食物中毒和混合型食物中毒。,感染型食物中毒,指食物被污染并繁殖了大量食物中毒性微生物（包括病原菌和条件致病菌，如沙、志、金、变形、蜡样、副溶、耶尔森、产气荚膜梭菌、枯草杆菌等）这种含有大量活菌（一般在107/g以上）的食物被摄入机体后，引起一系列消化道症状的现象，称
4、为感染型食物中毒，此类种毒是由细菌本身引起。,毒素型食物中毒,食物被能产生毒素的微生物如葡萄球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等污染，并在适宜的条件下生长繁殖，产生了某种毒素，这种毒素同污染的微生物一起或单独随食物被摄入体内，所引起的一系列的中毒现象，称为毒素型食物中毒。,混合型食物中毒,有的细菌性食物中毒，有感染型食物中毒的特征，又具有毒素型食物中毒的特征，称为混合型食物中毒。如产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌等引起的食物中毒，这种食物中毒在检验时，应得视毒素养的检测。,样 品 采 集,标本是进行一切实验室检测的基础；所有实验室检测的结果都依赖于所得到标本的质量；直接关系到实验室检测的准确性与效率；,食
5、物中毒标本的采集原则,1 典型性原则食物中毒标本的采集不同于卫生评价采样，应根据可疑食物的性质采集可能含毒最多的标本。2 适时性原则为了防止可疑食物丢失和被检物质组分发生变化，保证得到正确结论必须尽快采样送检。流调人员到达现场后应及时采样送检。3 适量性原则 由于引起食物中毒的毒物种类繁多，有时需实验室检索的项目很多，这要求有一定的样本量，在可能的情况下尽量多采。,采样前的准备(1),人员的准备：一般要指派2名以上专业人员赶赴现场，必要时还需要检验人员和其他部门有关人员协作前往。 交通工具准备： 在接到疑似食物中毒报告后，在城区1小时、郊区2小时内到达现场。,采样前的准备(2),调查采样箱准备
6、：属常用的物品，应提前准备，定期检查，及时补充。常备以下物品： 1、采样工具：注射器、肛拭子、消毒棉签、消毒纱布、调匙、勺子、夹子、镊子、剪刀、酒精灯、标号用品、 75%酒精、其他消毒灭菌器具、吸管、火柴等。 2、样品容器：灭菌塑料袋、广口瓶、灭菌试管、灭菌粪便盒、样品冷藏设施等。,采样前的准备(3),现场快速检验、测量设备：食物中毒快速检样箱，食品温度测试计、消毒剂浓度检测试纸等。调查用表：食物中毒事故个案调查登记表、调查笔录、样品采集记录表、样品送检单、调查结果汇总表、空白纸等参考资料：食物中毒诊断标准、有关卫生部规章、参考书籍等。其它有关物品：如便携式电脑、手机或对讲机等通讯设施以及用于
7、保存运送培养基的冰箱、冰块等 取证工具：照相机、摄像机等,采样用容器和试剂要求,1. 采样容器应采用洁净、无色、无毒的聚乙烯塑料或硬质玻璃（又称硼硅玻璃）。样品瓶必须专瓶专用，切不可用实验室装过试剂的瓶作采样瓶。2.用于微生物检验容器基本要求是选耐高温、无毒、耐用材料制成，容器包装好后可防渗漏，能承受空中或地面运送过程中可能发生的温度和压力变化。所有采样用具、容器需严格灭菌，并且不能存放过长时间，防止污染影响检验结果。、采样用的生理盐水、运送培养基及有关试剂等都应该满足新鲜、无菌的要求，同时应符合采样所需要的试剂量，如运送粪便的培养基为5ml/管为宜。,细菌性食物中毒标本的采集（1）,剩余食物
8、：采集残余食物时应尽量避免采集不相干的标本。残余食物用灭菌工具采取，置于灭菌容器内。如无剩余食物，可用灭菌棉拭在可疑食物容器内涂擦，置于装有少量生理盐水试管内。体积较大的肉及鱼等，应将表面烧灼灭菌后割取内部肌肉，置于灭菌容器内。可凝的罐头可直接送检，如仅剩余空盒，可将空盒送检。炊事用具：如锅、刀、抹布、砧板等，可用棉试大用具上涂擦，置于装有少量生理盐水的试管中。如砧板已洗过，可用刀用力刮取表面层木屑，置于灭菌容器中。,细菌性食物中毒标本的采集（2）,粪便、肛拭：粪便标本应尽量在病程早期和治疗前采集，同时应采集新鲜粪便，选取有脓血、粘液部分3-5克、水样便取含絮状物的2-5ml，盛于无菌容器中及
9、时送检。若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4-5cm深处（小儿2-3cm），轻轻转动一圈，擦取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检。注意为保证多个检验项目的开展，同一病人应至少采集2支肛拭,细菌性食物中毒标本的采集（3）,呕吐物：直接放入无菌容器中及时送检 咽拭样品：采集时应将棉签檫拭咽喉及扁桃体红肿处（特别是白膜处），然后将棉签插入4-5ml生理盐水中，尾部弃去 血液：采集患者急性发病期（3天内）和恢复期（2周左右）各3ml全血分离血清送检,检验项目,霍乱弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、沙门菌、变形杆菌、致泻性大肠埃希菌、
10、空肠弯曲菌、小肠结肠耶尔森菌、志贺菌、溶血性链球菌及单核细胞增生李斯特菌等引起的细菌性食物中毒样品检验,2019/6/22,19,中毒特征,检验宗旨,竭尽全力尽快找到病原体快速、准确可与传统方法不一定完全相同,检验程序,样品采集 初步检验活菌数、直接镜检(涂片染色镜检) 各种致病菌荧光PCR筛查 分离培养 (包括增菌培养和直接平板培养) 初筛试验 纯培养 全面鉴定（生化试验、血清分型、噬菌体试验等） 报告,直接涂片染色镜检,观察存在于检品中特种形态的细菌如霍乱弧菌、弯曲菌、球菌等，为进一步的检验提供有用的信息,检样的处理,病源检样因含较多病原菌而一般无须做预增菌处理，但若病源检样为服过抗生素后
11、采集的检样应按检验项目要求而进行预增菌处理以保护和放大目的病原菌直接插入2ml 预增管37预增菌46h,直接培养,将无须做增菌处理的病源检样按检验项目要求直接接种于各相应培养基,增菌及分离培养,将预增菌处理后的服过抗生素后采集的病源检样按检验项目要求接种各相应增菌液进行增菌 增菌培养后接种于各相应选择性培养基进行分离培养,初筛试验,克氏双糖/三糖铁/肠道综合发酵管1、管2PCRVIDAS,可疑菌的鉴定,全面生化试验（API、ATB、VETIK、IDS、SWF、手工鉴定等） 噬菌体试验 血清分型 毒素或毒素基因测试,毒素或毒素基因测试,霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、EIEC侵袭毒素、ETEC肠
12、毒素按国标方法进行动物试验或酶联免疫试验（VIDAS等）毒素基因测试：霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、致泻性大肠埃希菌的所有毒力基因均可用PCR检测，特别是对致泻性大肠埃希菌的定论应以毒素或毒素基因为准,患者血清的试验,疑似伤寒或副伤寒的患者应取发病一周的血清做肥达氏反应，用作辅助诊断 将患者急性期和恢复期的血清做凝集效价的对比，4倍增长可确诊,检验结果的判定,应以找到病原体或其毒素为最终结论，在此之前所有的快速检验方法如PCR、VIDAS等得到的结果仅供参考 应注意非病源检样与病源检样检出的病原体的统一性,检验结果的判定原则（1）,多数患者样品中检出的致病意义明确的细菌在种类、生化和/或血清
13、型、毒素型均一致时，可报告为细菌性食物中毒的病原体,检验结果的判定原则（2）,非病源检样与病源检样检出占绝对优势但通常致病意义不甚明确的细菌如大肠艾希菌、溶藻弧菌等，且其在种类、生化和/或血清型均一致，同时本次细菌性食物中毒事件中非患者对照标本中未检出该菌时，应做该菌的毒素、毒素基因或动物试验，阳性结果可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体,检验结果的判定原则（3）,样品中检出的生化、血清符合致泻性大肠艾希菌、金黄色葡萄球菌，一定要以毒素、毒素基因测试阳性为最终结论报告蜡样芽胞杆菌在非病源检样中须达到105 cfu/g (ml)以上者才有报告价值,细菌检验重要筛检试验,接触酶试验氧化酶试验,氧化
14、酶试验,用于分辨G-杆菌中肠杆菌科及弧菌科两类细菌 革兰阴性杆菌 阳性反应弧菌科 阴性反应肠杆菌科,接触酶试验,用于分辨葡萄球菌及链球菌 革兰阳性球菌 阳性反应葡萄球菌 阴性反应链球菌,沙门氏菌检测,沙门氏菌食物中毒主要特征,来源: 生食和烹饪不完全的食物，主要是肉类蛋品。症状：恶心呕吐、胃痛、腹泻、出冷汗、发烧（38-40）。较重者可出现烦躁不安、昏迷、谵语、抽搐等中枢神经系统症状，也可以出现尿少、尿闭，呼吸困难等症状。同时还出现面色苍白、口唇青紫、四肢发凉、血压下降等周围循环衰竭症状，甚至休克，如不及时救治，最后可因循环衰竭而死亡。潜伏期一般为1236h，短者6h，长者4872h。,肠热症
15、-是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。急性肠炎（食物中毒）-是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。败血症-常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。,概况,1880年发现，至今已有2600种有动力（除鸡-雏沙门菌）大多产H2S （除副甲伤寒沙门菌等）产酸大多产气（除伤寒、鸡-雏沙门菌）靛基质-、蔗糖-、乳糖-甘露醇+符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原+、氧化酶-）,检 样,25g(ml)样品+225mlBPW,1ml+TTB10ml,1ml+SC10ml,361 ，8h-18h,BS,XLD(或HE、显色培养
16、基),挑取可疑菌落,42 1 ，18h24h,36 1 ，18h24h,36 1 ，40h48h,36 1 ，18h24h,沙门氏菌检验程序,生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+,A1,A2,A3,反应结果与左侧描述不符,甘露醇+、山梨醇+,ONPG-,沙门氏菌，血清学试验,非沙门氏菌,报 告,TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN,沙门氏菌菌落形态,BS琼脂：培养4048h，菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，光滑、边缘整齐、圆形，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形态成灰绿色菌落，周围培养基不变。HE琼脂：蓝绿色或蓝色，透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形，多数菌落
17、中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂：菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色，带或不带黑色中心。,沙门氏菌菌落形态,BS,亚硫酸铋琼脂（BS）,黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。,沙门氏菌菌落形态,PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 ,沙门氏菌菌落形态,XLD,XLD琼脂：粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。,沙门氏菌
18、菌落形态,HE,l 沙门氏菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。,PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 ,沙门氏菌显色培养基-CHRO,生化试验,自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h。,PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 ,血清学鉴定,血清学鉴定中的血清学分型为选择性试验项目.目前根据对某一特定O抗原共
19、同具有的标准，将沙门氏菌属分为AZ和O51 O67共42个O群，58种O抗原，63种H抗原。到1987年底为止，已有2213个血清型。我国已发现26个菌群、161个血清型。,沙门氏菌的血清分型,沙门氏菌主要有O和H两种抗原。少数菌具有表面抗原Vi。在这些菌群中，对人致病的沙门氏菌，通常为属于AF各O群的常见菌型。故用AF多价O血清对沙门氏菌进行的菌型鉴定，只是对于O抗原的第一步鉴定。若待测菌型不属于A到F群，仍要继续使用其他沙门氏菌因子血清中的多价O血清继续鉴定。而在确定了所属O群之后，还要进行H抗原的鉴定。必要时，还需进行Vi抗原的鉴定。,沙门氏菌血清试验,致病性的沙门氏菌绝大多数血清归在A
20、-F群内，所以检出疑似菌株应先凝集A-F群O多价血清，若凝集可按常见O因子检出频率，按照O4O10O9O7O8O19O2O11顺序凝集，可节省时间。H抗原可先凝集H多价1H多价4，再逐个凝集某个H多价凝集所含的H单因子血清。伤寒和丙型副伤寒杆菌在A-F群多价血清不凝集情况下，还应做Vi血清凝集。,P,第1位数 第2位数 第3位数,第4位数,第5位数,第6位数,第7位数,ON ADHG,LDC,ODC,CIT,H U2 RS E,TDA,IND,VP,GEL,GLU,MAN,INO,SOR,RGA,SAC,MEL,AMY,ARA,结O 果X 判定,1,2,4,1,2 4,1,2,4,1,2,4,
21、1,2,4,1,2,4,1,2,4,反应结果, , , ,沙,门氏,菌,应得数值,0,2,4,1,2 4,0,0,0,0,0,4,1,2,4,1,0,4,0,2,0,组合编码,6,7,0,4,7,5,2,API 20E,PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 ,沙门氏菌生化鉴定,志贺氏菌检测,概况,至今已有4群（A、B、C、D）、32种（A-痢疾志贺菌10个血清型； B 福氏志贺菌6个血清型+X、Y变种；C-鲍氏志贺菌15个血清型、D-宋内 1个血清型，S，R两相）无动力乳糖- （除宋内迟缓发酵+）不产H2S产酸不产气（除F6产极少量气泡）靛基质大多+（宋内-）、蔗糖-甘
22、露醇+（痢疾志贺菌为-）符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原+、氧化酶-）,增菌：用GN增菌液使处于濒死状态的细菌恢复活力,选择性平板分离培养：XLD+MAC/显色培养基,生化试验：可采用API 20E或VITEK2,血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种。,志贺氏菌操作流程,增 菌 培 养,用志贺氏菌增菌液增菌, 41.5 ，16 h20 h厌氧培养。,智能厌氧微需氧培养系统,（二）分 离 培 养,取增菌后的GN增菌液或志贺氏增菌肉汤分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或R&F志贺氏菌显色培养基平板上于36 1 培养20 h24 h，观察各个平板上生长的菌落形态若出现的菌落不典型或菌落
23、较小不易观察，则继续培养至48 h再进行观察。,初步生化鉴定,从平板上挑取34个可疑菌落，接种TSI和葡萄糖半固体培养基各一管，36培养1824h。,初步生化鉴定,TSI生长结果（现象）：斜面产碱仍为粉红色或红色；底层产酸不产气，变黄色；不产硫化氢，不产黑色。半固体培养基：沿线生长，无动力。,初步生化鉴定,可弃去地培养物：在TSI表面呈蔓延生长的。1824h内发酵乳糖、庶糖的。不分解葡萄糖，只在半固体培养基表面生长的。产气的。有动力的。产硫化氢的。,血清学分型（选做项目）,先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用B群福氏志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝
24、集，再用其群和型因子血清分别检查，福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表4。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其相和相血清检查；如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群痢疾志贺氏菌多价血清及112各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝集，可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用118各型因子血清检查。,志贺氏菌的O抗原,人们原来的认识认为血清学试验是特异性的，但是志贺氏菌的 O抗原和大肠埃希氏菌属关系密切，有半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些O抗原完全相同。相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。因此，生化试验对于属的鉴定是非常重要的。,若生化反应
25、符合，而血清四种多价-，考虑：A、C群志贺菌O抗原外有K包膜抗原遮蔽，煮沸后再凝可能是EIEC，再做大生化以鉴别宋内 的R相菌，用R相血清凝集可能是蜂窝哈夫尼亚菌，做大生化以鉴别可能是类志贺邻单胞菌，观察动力、氧化酶,报告方式,痢疾志贺菌1型 福氏志贺菌2a型福氏志贺菌X变种 鲍氏志贺菌13型宋内志贺菌S相,福建省福氏志贺菌优势血清型别,2005首次检出福氏志贺菌4c血清亚型（F4c），在随后的分离株中F4c亚型成为福建省福氏志贺菌分离株的优势血清型17/40(42.5%) 继往流行的福氏2a、1b 血清亚型分离的菌株数却减少 说明福建省福氏志贺菌优势血清型别在发生更替 。,金黄色葡萄球菌,金
26、葡菌食物中毒主要特征,来源：主要存在于人们的皮肤、鼻、喉、耳等部位。进食了被污染的肉类、乳品、定粉制品。症状：恶心、呕吐（频繁而剧烈），腹痛、腹泻，由于剧烈呕吐和腹泻，可引起大量失水而发生外周循环衰竭和虚脱。潜伏期：一般30min6h，最短为15min左右，很少有超过8h的。,金黄色葡萄球菌检验流程,金黄色葡萄球菌菌落形态,B-P琼脂：菌落圆形、凸起、湿润，直径23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈，接种针接触菌落有似奶油至树胶样硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观
27、可能粗糙并干燥。血平板：形成较菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。,BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,金黄色葡萄球菌菌落形态,完全溶血和不完全溶血,溶血,溶血,血浆凝固酶实验,可疑菌落1个（计数时取5个菌落分别接种）5mLBHI和营养琼脂斜面，36培养24h0.20.3mLBHI培养物+0.5mL兔血浆36水浴箱或培养箱每半小
28、时观察一次,观察6小时凝固为阳性,反之为阴性（同时以血浆凝固酶阳性和阴性葡萄球菌株的肉汤培养物作对照）。,4、金黄色葡萄球菌肠毒素的检测 一、动物学试验主要用幼猫和猴。 二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，方法主要有： 免疫琼脂扩散法 反向间接血凝试验 免疫荧光法 酶联免疫吸附法三、实时荧光定量PCR,副溶血性弧菌,副溶血性弧菌食物中毒是我国沿海地区、我省最常见的一种食物中毒,概况,副溶血弧菌系弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多 形态杆菌或稍弯曲弧菌。本菌嗜盐畏酸。最适宜的培养基：温度为3037，含盐2.
29、5%3%(若盐浓度低于0.5%则不生长），pH值为8.08.5。本菌对酸较敏感，当pH6以下即不能生长，在普通食醋中l一3min即死亡。在固体培养基上菌落常隆起，圆形，表面光滑，湿润。在3一35含盐水中繁殖迅速，每89min为一周期。对高温抵抗力小，50 20 min；65 5 min 或80 1 min 即可被杀死。本菌对常用消毒剂抵抗力很弱，可被低浓度的酚和煤酚皂溶液杀灭。,概况,氧化酶试验：副溶为氧化酶阳性三糖铁试验：底层变黄，斜面不变或红色加深、无硫化氢、无气泡、有动力。 嗜盐性试验：副溶在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在7%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。,弧菌属中的鉴
30、别特点,梅氏弧菌氧化酶阴性，其余阳性蔗糖阴性：副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、霍利斯弧菌、其余的在TCBS上为黄色菌落。无盐生长：霍乱、拟态10%NaCl生长：溶藻弧菌。,副溶血性弧菌检验流程,副溶血性弧菌菌落形态,TCBS琼脂：呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径23mm。涂片镜检：革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。,副溶血性弧菌菌落特征,副溶血性弧菌菌落特征,霍乱、副溶、随培养时间的延长霍乱的黄色菌落逐渐变蓝,鉴定,生化性状：葡萄糖+、分解葡萄糖产气-、甘露醇+、H2S-、氧化酶+、动力+、蔗糖-、乳糖-、赖氨酸脱羧酶+、V-P-
31、、ONPG-。嗜盐试验：10氯化钠胰胨水不生长或微弱生长，7氯化钠胰胨水生长旺盛。,变形杆菌,概况,变形杆菌属(Proteus) 包括: 普通变形杆菌(Pvulgaris) 奇异变形杆菌(P. mirabilis) 产粘变形杆菌（P.myxofaciens）。 变形杆菌为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，有明显的多形性。无芽孢无荚膜，有周身鞭毛，运动活泼。为需氧或兼性厌氧，对营养要求不高，生长温度为1043。 不耐热，60530min皆可杀死。 变形杆菌可产生肠毒素，此肠毒素为蛋白质和碳水化合物的复合物，具抗原性。,变形杆菌检验流程,变形杆菌菌落形态,SS琼脂：形成单个菌落，菌落圆形、扁薄透明或半透明
32、，有的菌落边缘呈扩散状，对光观察，菌落周围淡蓝色中心稍厚，有黏性，打开平皿时有臭味。EMB琼脂：无色透明菌落，普通变形杆菌和奇异变形杆菌在伊红美蓝平板上可呈现片状蔓延生长。,变形杆菌菌落特征,普平,鉴定,生化实验：乳糖反应阴性（TSI斜面红色）、葡萄糖产酸（TSI底层黄色）产气或只产酸不产气，硫化氢阳性或阴性、尿素阳性、苯丙氨酸阳性者进行系统生化鉴定，判定种属或群。血清学实验：变形杆菌食物中毒需对来自可疑食物与患者的菌株进行血清型别鉴定，以判定其同源性，方法：将待试菌株分别点种在普通营养琼脂平板的两端，待两侧的菌株蔓延生长到平板中间，菌苔完全融合，说明两株细菌没有拮抗现象。,蜡样芽孢杆菌,蜡样
33、芽孢杆菌食物中毒主要特征,来源：米食、乳制品、畜禽肉类制品、等。剩饭，特别是大米饭，其次小米饭、高粱米饭等剩饭。除米饭有时微有发粘、入口不爽或稍带异味外，大多数食品的感官性状正常。 症状：呕吐型：主要表现为恶心、呕吐、腹痛，腹泻。此外，头昏、四肢无力、口干、寒战、结膜充血等症亦有发生。该型主要是由剩米饭或炒饭引起的。该菌易在米饭中繁殖并产生耐热性肠毒素。与葡萄球菌食物中毒在潜伏期、中毒表现方面非常相似，易混淆。腹泻型：主要表现有腹泻、腹痛。水样便，一般无发热，可有轻度恶心，但呕吐罕见。病程稍长，16136h。主要是蜡样芽孢杆菌在食品中产生不耐热肠毒素所致,与产气荚膜梭菌食物中毒相似，应注意鉴别
34、潜伏期：呕吐型：潜伏期一般13h ，短者0.5h，长者5h ；腹泻型 ：潜伏期长,一般1012h , 短者6h ,长者16h 。,概况,革兰氏阳性、能形成芽孢、需氧或兼性厌氧大杆菌。芽孢不大于菌体宽度，位于中央或稍偏一端，无荚膜，有周身鞭毛。 生长温度范围是1050，最适生长温度为2835，10以下不能繁殖。 繁殖体较耐热，加热100经20min被杀死；芽孢能耐受10030min，干热170经60min才能杀死。生长的pH值范围为4.99.3。,蜡样芽孢杆菌检验流程,蜡样芽孢杆菌菌落形态,MYP琼脂：典型菌落为灰白色至微粉红色（不发酵甘露醇），周围有白色至淡粉红色沉淀环（产生卵磷脂酶）。营养琼
35、脂：典型菌落在为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm10 mm 。革兰染色菌体形态：革兰氏阳性大杆菌，宽1m或以上，芽胞呈圆形，不突出菌体，多位于中央或稍偏于一端。,蜡样芽孢杆菌菌落形态特征,蜡样芽孢杆菌在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）上,蜡样芽胞杆菌菌落形态特征,蜡样芽胞杆菌在营养琼脂平板上,生化特性,产生溶血素：使胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB）中的血细胞发生溶血。,蜡样芽胞杆菌,完全溶血环,蜡样芽孢杆菌菌落形态特征,琼脂平板上蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的
36、溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽胞杆菌为不溶血。,生化特性,根状生长试验：挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上，30 1 培养24 h2 h。,蕈状芽胞杆菌,蜡样芽胞杆菌,蜡样芽孢杆菌染色形态,蛋白质毒素结晶试验,取经30 1 培养24 h2 h并于室温放置3 d4 d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满0.5碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min2 min，移去火焰，再更换染色液再次加温染色30 s，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。,蛋白质毒素结晶试验,观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富，应将培养物置室温2 d3 d再行检查。放置3d4d以上的苏云金芽胞杆菌培养物有大量的结晶体，但是只有在芽胞裂解通过上述染色方法才能见到。然而，除非见到芽胞，否则培养物应在室温继续放置几天以重新检查毒素晶体。其它芽胞杆菌不产生蛋白质毒素晶体。,谢谢！,
