1、第十一讲 香豆素类分析,香豆素类化合物,香豆素类化合物最早由豆科植物香豆中分得，因具芳香气味而称香豆素。广泛存在于高等植物及微生物代谢中。目前得天然产物九百多种。,香豆素类化合物具有多方面得生物活性。如秦皮中得七叶内酯和七叶苷具治疗细菌性痢疾作用。,香豆素类化合物,香豆素类化合物,某些香豆素类化合物对人和动物有一定毒性，尤其是对肝脏的损伤严重，如粮食霉变后黄曲霉菌代谢产生的黄曲酶素B1。,香豆素类化合物,常见的含有香豆素类化合物的中药,表1：常见含有香豆素类化合物的中药药材及其有效成分,香豆素类化合物结构与分类,香豆素类化合物的母核由顺式邻羟基桂皮酸分子内脱水而成的内酯化合物。可视为苯骈-吡喃
2、酮。,H2O,顺式邻羟基桂皮酸,香豆素母核（苯骈-吡喃酮）,香豆素类化合物结构与分类,分类简单香豆素类化合物呋喃香豆素类化合物吡喃香豆素类化合物异香豆素类化合物其他,香豆素类化合物分类1.简单香豆素类：只在苯环上有取代基。,七叶内酯 RH,七叶苷 Rglc,蛇床子素,当归内酯,治疗脚癣、湿疹、阴道滴虫,抗菌、治疗细菌性痢疾,香豆素类化合物结构与分类,香豆素类化合物分类2.呋喃香豆素类：母核上的异戊烯基C2位与邻位 羟基环合。,香豆素类化合物结构与分类,补骨内酯,欧前胡内酯,白芷内酯,茴芹内酯,黄曲霉素B1,抗真菌,生物毒性，对肝脏损伤,香豆素类化合物结构与分类,香豆素类化合物分类3.吡喃香豆素
3、:母核C6或C8与异戊烯基C3位羟基环合。,美花椒内酯,前胡豆素内酯,别美花椒内酯,香豆素类化合物结构与分类,香豆素类化合物分类4.异香豆素类：母核1位O与2位羰基位置互换。,仙鹤草内酯,茵陈炔内酯,岩白菜素,止咳作用，治疗慢性支气管炎,治疗急慢性肝炎,香豆素类化合物结构与分类,香豆素类化合物分类5.其他：,亮菌甲素,蟛蜞菊内酯,紫苜蓿酚,双香豆素类，抗维生素K预防血液凝固,香豆素类化合物结构与分类,香豆素类化合物的理化性质,香豆素类化合物性状游离的香豆素类化合物大多为结晶，多数具有香气。小分子的尚具有挥发性和升华性。香豆素苷无香味、无挥发性和升华性。香豆素类化合物有的有色、有的无色，如七叶内
4、酯为黄色，七叶苷无色。 常具有较强荧光，有的在可见光下即可见到。,香豆素类化合物溶解性游离的香豆素类化合物一般不溶或难溶于冷水，极性大的可溶于沸水。易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂，甚至可溶于石油醚，如蛇床子素。香豆素苷能溶于水、甲醇和乙醇等亲水性有机溶剂，难溶于苯、氯仿和乙醚等亲脂性有机溶剂。含酚羟基的香豆素类能溶于氢氧化钾等强碱水溶液。,香豆素类化合物的理化性质,酸性及内酯性质含酚羟基的香豆素类具酸性可溶于稀强碱水溶液。不含酚羟基的香豆素亦可在加热条件下溶于稀强碱溶液。这是由于母核内酯环在强碱溶液中发生水解开环， 产生水溶性顺式邻羟基桂皮酸盐。,H2O,顺式邻羟基桂皮酸盐,香豆素母核
5、（苯骈-吡喃酮）,香豆素类化合物的理化性质,OH,酸性及内酯性质母核内酯环在强碱溶液中发生水解开环而溶于水，但在加酸酸化后又可重新环合成原来的内酯环结构。常可利用开环溶，闭环不溶的性质进行提取分离，即碱溶酸沉淀法。但此法对香豆素苷类不适用，因为苷类使水溶性物质，酸化后不能产生沉淀。注意：用于开环的苛性碱浓度一般小于1。与浓碱共沸则发生母核降解，生成酚类或酚酸。,香豆素类化合物的理化性质,酸性及内酯性质香豆素内酯环开环后如长时间与碱接触并加热、或开环时所用碱浓度过大、或长时间与紫外线接触，开环生成的顺式邻羟基桂皮酸盐可转变为稳定的反式邻羟基桂皮酸盐，此时加酸酸化只能产生邻羟基桂皮酸，不能再发生环
6、合作用生成原香豆素母核。,H2O,顺式邻羟基桂皮酸盐,香豆素,OH长时间,或UV下,反式邻羟基桂皮酸盐,反式邻羟基桂皮酸,H,香豆素类化合物的理化性质,香豆素类化合物的提取与分离,提取主要利用香豆素的溶解性能的不同而采用溶剂提取法。香豆素具有内酯环结构，利用其在稀苛性碱溶液中遇热可开环成盐的性质，可采用碱水提取法。小分子游离香豆素具有挥发性，采用水蒸气蒸馏法。,香豆素类化合物的提取与分离,提取溶剂提取法一般选用甲醇和乙醇为提取溶剂，可提取出植物中的游离香豆素和香豆素苷。若提取游离香豆素，可选用亲脂性有机溶剂，其中以乙醚的溶解性能较好。,提取碱溶酸沉法酚羟基，可直接用稀苛性碱溶液提取，也可利用香
7、豆素内酯环，用0.5%氢氧化钠加热提取。提取液经冷却后用乙醚去处杂质，然后加酸调pH至中性，适当浓缩，酸化后游离香豆素即可析出游离香豆素若存在，水溶性较小的香豆素苷也可析出。,香豆素类化合物的提取与分离,分离主要利用混合物中各组分极性不同，采用系统溶剂法或吸附色谱法。系统溶剂法 甲醇或乙醇提取液中含有各种游离香豆素和苷类，它们存在明显的极性差异，利用这些差异在不同溶剂中溶解度的不同进行分离的方法。,香豆素类化合物的提取与分离,分离系统溶剂法将提取液回收醇，加适量水后依次用不同极性的有机溶剂，由低极性至高极性萃取。或将提取液回收醇，拌入硅藻土，烘干粉碎后，置连续回流提取器中，用不同极性的有机溶剂
8、依次提取。常用的溶剂：,香豆素类化合物的提取与分离,石油醚：主要含有脂溶性色素等杂质，有些香豆素可能不含羟基 乙醚：主要含有游离香豆素 乙酸乙酯：可能含有极性羟的游离香豆素和极性低的香豆素苷 丙酮和甲醇：主要含有不同极性的香豆素苷,分离色谱法通常用硅胶，或中性和酸性氧化铝。硅胶色谱法： 常用的洗脱剂有己烷与乙醚，乙醚与乙酸乙酯等混合溶剂，梯度洗脱。氧化铝色谱法： 香豆素常含酚羟基，显弱酸性，故用氧化铝柱色谱法分离时，采用中性或酸性氧化铝，而不用碱性氧化铝。 常用洗脱剂为：石油醚、正己烷、氯仿、与乙酸乙酯的混合溶剂梯度洗脱。,香豆素类化合物的提取与分离,提取分离实例秦皮秦皮为木犀科多种白蜡树属植
9、物的杆皮或枝皮，主要有效成分为七叶内酯和七叶苷，具有抗菌、镇痛、止咳去痰等功效。七叶内酯极性较大，难溶于氯仿等亲脂性有机溶剂，溶于亲水性有机溶剂和乙酸乙酯，也可溶于碱水。七叶苷溶于水和亲水性有机溶剂及碱水，难溶于乙酸乙酯，不溶于亲脂性有机溶剂。,香豆素类化合物的提取与分离,提取分离实例秦皮,秦皮粗粉,95EtOH,回流提取,乙醇提取物,加水温热溶解,等体积CHCl3萃取,CHCl3（脂溶性杂质）,H2O,EtOAc萃取,EtOAc,H2O,无水Na2SO4干燥,回收EtOAc,残留物,MeOH反复结晶,七叶内酯,n-BuOH萃取,n-BuOH,减压浓缩至小体积,静置,白色粉末,七叶苷,MeOH
10、重结晶,黄色,白色,香豆素类化合物的提取与分离,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 1.荧光香豆素类化合物在紫外光下大多具有荧光，在碱液中荧光增强。荧光的强弱有无与分子中取代基的种类和存在位置有关。如:香豆素母核无荧光； 7-羟基香豆素强蓝色荧光； 6,7-羟基香豆素较弱荧光； 7,8-羟基香豆素无荧光； 醚化羟基香豆素荧光减弱，颜色变紫； 呋喃香豆素荧光较弱，一般呈蓝或棕色。,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 1.荧光,香豆素母核无荧光,7-羟基香豆素强蓝色荧光，可见光下可看到,6,7-羟基香豆素较弱荧光,7,8-羟基香豆素无荧光,醚化羟基香豆素荧光减弱， 颜色变紫,呋喃香豆素荧光较弱，一般呈蓝或
11、棕色,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 2.显色反应,酚羟基的鉴别反应,具酚羟基的香豆素类化合物可与多种鉴别酚羟基的试剂反应，如三氯化铁。若酚羟基邻、对位未被取代，则可与重氮化试剂反应，生成偶氮染料衍生物，呈红色或紫红色。若酚羟基对位未被取代、或香豆素母核C6位未被取代，在碱液重发生内酯环开环，产生的顺邻羟基桂皮酸对位氢（相当与母核C6位）都可与Gibbs或Emerson试剂发生反应。,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 2.显色反应,Gibbs反应,pH=910,HCl,2,6-二溴苯醌氯亚胺,蓝色,取样品乙醇溶液1mL，加0.5% 2,6-二溴（或氯）苯醌-4-氯亚胺乙醇溶 液23滴，加碳酸钠水
12、溶液调pH至99.6,呈蓝色或蓝绿色，表示C6位无取代的香豆素或酚羟基对位无取代的化合物。,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 2.显色反应,Emerson反应,O,K3Fe(CN)6,4-氨基安替比林,红色,样品的乙醇溶液底价在滤纸上，喷2% 4-氨基安替比林乙醇溶液，再喷8铁氰化钾水溶液，即显色，放入密闭氨气缸内，则呈橙红至深红色。,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 2.显色反应 香豆素内酯环在碱性条件下开环，与盐酸羟胺试剂缩合成异羟肟酸，再于酸性条件下与三价铁离子络合成盐而显红色。酯、内酯、酸酐均呈正反应。,内酯环的鉴别反应-异羟肟酸铁反应,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 2.显色反应,异羟肟
13、酸衍生物,红色,OH,HONH2HCl,Fe3+,H+,异羟肟酸铁衍生物,取样品的醇溶液1mL，加新鲜的1mol/L盐酸羟胺醇溶液0.5mL、6mol/L氢氧化钾醇溶液0.2mL，加热至沸，冷后加5盐酸酸化，然后滴加 1三氯化铁溶液12滴，出现紫红色表示有香豆素类化合物。,异羟肟酸铁反应,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 3.色谱鉴别最常用的吸附剂是硅胶，而纤维素和中性氧化铝较少采用。由于香豆素化合物常显中性或弱酸性，故展开剂多为中等极性的pH值为中性或微酸性混合试剂。简单香豆素：甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5:4:1） 苯-丙酮（9:1）呋喃香豆素：正丁烷-乙酸乙酯（7:3） 石油醚-二氧六环（5:
14、1）或氯仿香豆素苷类：正丁醇-醋酸-水（4:1:5）,薄层色谱法,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 3.色谱鉴别香豆素纸色谱法常用展开剂为水饱和的正丁醇或氯仿等。含羟基香豆素选用酸性展开剂，避免中性展开剂拖尾，碱性展开剂则因成盐而使Rf值偏小。呋喃香豆素亲脂性较大，用二甲基甲酰胺为固定相，用己烷-苯（8:2）为展开剂。含邻二酚羟基或香豆素苷类可先将色谱纸用0.5%硼砂溶液处理，再用0.5%硼砂溶液饱和的正丁醇为展开剂。,纸色谱法,香豆素类化合物的鉴别,鉴别 - 3.色谱鉴别紫外光下观察斑点： 含羟基香豆素有较强的荧光，呋喃香豆素类荧光较弱，用氨气熏或喷10氢氧化钾醇液，可使荧光增强。常可见蓝、棕
15、、绿、黄色的荧光。常用显色剂 三氯化铁试剂：显绿、蓝、棕、红等色； 重氮试剂：显红、紫色； 异羟肟酸铁试剂：显红色； Emerson试剂：显深红或橙红色； Gibbs试剂：显蓝色。,色谱显色,鉴别实例 秦皮 秦皮为木犀科多种白蜡树属植物的杆皮或枝皮，主要有效成分为七叶内酯和七叶苷。,七叶内酯 RH,七叶苷 Rglc,香豆素类化合物的波谱鉴别,红外光谱（IR）母核：内酯17501700cm1最强峰，12701220cm 1 ，11001000cm 1强吸收。芳环：16601600cm 1 有三个较强吸收。判断呋喃环：C-H在31753025cm 1 有较弱小但非常尖锐的吸收峰。,香豆素类化合物的
16、波谱鉴别,紫外光谱（UV）苯环：274nm （lg 4.03） 。-吡喃酮：311nm （lg 3.72）含氧取代：红移，如7-含氧取代，有217nm及315325nm强吸收峰（lg 4）。含酚羟基者在OH中：红移，增强。,香豆素类化合物的波谱鉴别,核磁共振谱（NMR）母核的13C-NMR特征,定量分析,荧光分光光度法TLC-SCANUVGCHPLC,分光光度法,香豆素在紫外光的照射下显蓝色荧光，可作为定性鉴别和定量测定的依据。香豆素类化合物羟基和芳环形成的共轭体系具较强的紫外特征吸收，不同的香豆素类化合物在不同 pH 条件下表现出不同的光谱特征，因此可用紫外 - 可见分光光度法测定生药中总香
17、豆素的含量。,蛇床子中香豆素类成分的气相色谱分析,色谱柱： DB 2 1 石英毛细管柱 (25m 0 . 32mm ， 0 . 53 m m ) ； 进样口温度： 280 ； 氢火焰离子检测器 ， 检测器温度 350 ； 二阶程序升温 ， 起始温度 190 (20 min) ， 升温速率 1 ： 10 / min ， 终温 1 ： 240 (10 min) ； 升温速率 2 ： 15 / min ， 终温 2 ： 280 / min (15 min) ；仪器参数 ： H 2 23mL / min ， N 2 和 空气 4kg / cm 2 ， 尾吹 35mL / min ， 分流比 15 1
18、， 衰减 64 ， 柱前压 13Pa,图 3-7 蛇床子中香豆素类成分的气相色谱图 A. 对照品 ; B. 湖南益阳 ; C. 河北衡水 ; D. 辽宁沈阳,对照品 蛇床子素 (osthole) 、佛手柑内酯 (bergapten) 、花椒毒素 (xanthotoxin) 、欧前胡素 (imperatorin) 、异虎耳草素 (isopimpinellin) 、 O - 乙酰基哥伦比亚内酯 ( O - acetylcolumbianatin) 、哥伦比亚内酯 (columbianadin) 、 O - 乙酰异蛇床素 (cniforin A) 、爱得尔庭 (edultin) 。内标物 正三十烷，
19、为色谱纯。,白芷含量测定,色谱柱:岛津ULTRON VX-ODS(250mm*4.6mm,5um)色谱柱;流动相:乙腈2水(V:V=65:35);流速:0.8mL/min;检测波长249nm;柱温:室温,前胡含量测定色谱条件与系统适用性试验:C18色谱柱;乙腈-水(60:40)为流动相;流速:1mL/min;柱温:40;检测波长245nm;进样量10uL理论板数按欧前胡素峰计算,应不低于2000,对照品溶液的制备: 分别精密称取对照品秦皮甲素2mg, 置5mL量瓶中, 秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷各1mg, 置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得(含秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷分别为0.
20、4、0.1、0.1、0.1mg/m L)。供试品溶液的制备: 取样品粉末(过四号筛) 约0.5g, 精密称定, 置50mL锥形瓶中, 精密加入甲醇25mL , 称定质量, 加热回流1 h, 取下,放冷, 再称定质量, 用甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。,HPLC 法测定秦皮中 香豆素类成分的含量,刘丽梅, 李曼玲, 冯伟红等. HPLC 法测定秦皮中香豆素类成分的含量. 中草药,2004,7(35):819:822,色谱条件: 色谱柱: Dimasil C18柱(250 mm 4. 6 mm , 5 m) , 流动相: 甲醇-水-冰醋酸(6400.1) ; 检测波长: 340 nm; 体积流量: 1.5mL /min; 柱温: 40 。,a秦皮甲素b秦皮乙素c秦皮苷d秦皮素秦皮对照品(A) 及样品(B) 图谱,HPLC 法测定秦皮中 香豆素类成分的含量,刘丽梅, 李曼玲, 冯伟红等. HPLC 法测定秦皮中香豆素类成分的含量. 中草药,2004,7(35):819:822,
