1、吉林省食品安全地方标准 动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法编制说明一、任务来源动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法是吉林省畜牧兽医科学研究院根据吉林省食品安全工作的需要，通过吉林省卫生厅提出申请，由吉林省卫生厅下达2012年吉林省食品安全地方标准制（修）订项目。项目编号（DBS22/045-2012），标准原名称：动物源性食品中沙门氏菌LAMP检测方法。技术归口单位是吉林省卫生厅。吉林省畜牧兽医科学研究院承担了该标准的起草制定工作。二、标准编制的目的近年来世界范围内的食品安全恶性事件屡屡发生，尤其在我国，食品污染与食源性 了 扩 的 卫生 ， 的 定， 国食品发currency1
2、的要“。在动物源性食品中，菌性食物中fifl ，由沙门菌起的食物中在食物中中 。在起的沙门菌中的食品中， 0是”等畜 品。的污染：国内沙门菌检出 在11-5。”的污染：国内”其制品沙门菌检出 -4。由食”起 的 增的 。环 污染：食品在工 出 过 中 沙门菌污染，导 等 。“ ， 的检测方法 动物性食品 ， 检测出食品中是 该菌是 沙门菌食物中， 的要 。目 ，沙门菌的检测方法要 的菌 定方法， 需要4 -5 ， 较费 费力。各 PCR 方法敏感 ，但由需要昂贵的仪器设备繁琐的电泳过 等缺点，使其难以在基层普 推广。环介导等温扩增（loop me iate isothermal amplica
3、tion，LAMP）是 新颖的核酸扩增技1术，在等温65左右，仅需几十钟，即可实现核酸的高 扩增，具高度特异性 敏感性。LAMP技术 需要模板的热变性，长 间温度循环，在等温条件下扩增， “温度改变而造 间的浪费， 需要昂贵的仪器设备，更适基层应。本标准以沙门菌STN基“（ 基“）靶基“ LAMP方法，检测动物源性食品中的沙门菌，食品安全检测提供技术支持，可 灵敏高 的检出沙门菌， 们沙门菌食物中， ，维 卫生安全。三、编制原则和依据（ ）编制原则1政策性原则：本标准编写过 遵循国家相 法律法规 国家标准。2先 性原则：以国内外相 文献资料参考，力求反映该领域fi新的科技 果。以国内同标准制订
4、编写方法基础， 本标准 规范充实 创新使之具先 性。经济性原则：在本标准编制过 ，从获取信息起草实验室临 验 求 的各 环 ，在 的 提下力 ， 的经费 各 工作。4适性原则：标准 国内外沙门菌检测技术的 经验， 经实验室与临 应验 ， 全 国家标准的要求编写，内 全 ， 规范，可作 实性 。5 性原则：本标准参 国内相 标准的编写 达方法，力求与国内相 标准的 。6规范 原则：本标准是 B/T 11-200 B/T 200014-2001的要求来编写的。（ ） 定标准要内 的 据本标准的要 据是参考 文献资料，通过实验室研究 验临 验 ， 参考其资料经验 提出。本标准起草，以沙门菌STN基“
5、（ 基“）靶基“， 了沙门菌LAMP检测方法， 应临 。该方法灵敏特异 ， fl规PCR2具更的灵敏性 特异性，技术方法 可currency1，临 应 果。“技术支持 本标准起草制定fi。本标准 fl范围术 与定 与料 作 果定 等，LAMP检测方法是本标准的核”内 。本标准提出的检测技术， 验 明具的特异性敏感性 可性， 检验需求， 提高 原的检出 ， 推广， 与国相 技术同。四、标准制定的主要过程标准起草 从2012年相 资料 文献， 定标准编写目标 据，同 起草制（修）订吉林地方标准项目 ， currency1标准的申工作。2012年下 省卫生厅下达的地方标准制定（修订）项目的通 ， 标
6、准起草工作 ， 定标准起草编写方 间 度， 实 。本标准起草 ： 国明 文 。（ ）要起草 工作工持 制定本标准全 工作 实验设方 与验。 国明 文 。 品的 与 实验方法的 以特异性敏感性性 验等实验室 作 国明 文 基层实验验 。（ ）检测方法 与验 本标准的要 据是参考 文献资料， 我国国以吉林省实，通过实验室研究 验临 验 。1物设与 2 定实验仪器 LAMP 作 4制定定标准。（ ）起草标准文本根据实验 果， B/T 11-200标准 工作导则 ：标准的 编写规则 B/T 200014-2001标准编写规则 学方法要求 标准 求 的编写。3（） 求 标准 求 生 技术推广科研 学 标
7、准 管等单位的吉林省较权威专家 实践经验的技术 （10 ）， 求各方 ，反馈28条 汇总，修改补充标准 求 ，起草 标准讨论 ，同 修改 标准编制说明。（五）核 验根据 规定， 同的40份阳性品 20份阴性品， 吉林省 预防控制中”吉林省动物疫 预防控制中”吉林出入 检验检疫局检验检疫技术中”吉林农业 学动物科学技术学院吉林省畜 品安全中”等五家单位的检测实验室，本方法 了核 验， 果 。（六）召标准审查 ， 批 邀请食品安全 业相 专家召评审 ， 动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法 审查， 提出修改 ，fi终 动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法 审 。五、标准编制中要说明的几
8、个问题（ ）动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法本标准适动物源性食品（”）中沙门菌检测，故标准起名动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法。（ ）标准要内 说明(如技术指标参数 性要求 验方法检验规则等的论据) 本标准的要内 是通过LAMP方法 临 料品或者菌培养物中沙门菌 检测与 。本标准的 过 要 了以下 验：1 料1.1 要 菌基“ DNA提取 LAMP 电泳 其 1.2 LAMP物（ 1）1.3 标准菌株 检测品沙门菌标准参考株作阳性 。相 菌H2O作阴性 。吉林省各地 的品 菌培养物 检测。4表1：特异性引物序列及扩增片段长度沙门菌STN基“LAMP检测物 靶片 210bpL
9、abel Len Tm 5dG 3dG GC rate Sequence（53）F3 20 59.64 -4.46 -4.34 0.55 CCTTTCCCGCTATCGGTAACB3 19 59.84 -5.75 -4.43 0.58 GGATGCCCAAAGCAGAGAGFIP 39 GGCCGCCAGGGAACGATTAG-TGATGATAACGCGGTCGGTBIP 40 TTCAACAGCACCTGAGTCAGCC-TTCACGGCGAATGAGACGF2 19 60.77 -4.32 -6.18 0.53 TGATGATAACGCGGTCGGTF1c 20 64.90 -8.37 -
10、3.08 0.65 GGCCGCCAGGGAACGATTAGB2 18 59.13 -5.35 -5.53 0.56 TTCACGGCGAATGAGACGB1c 22 64.78 -4.18 -6.10 0.55 TTCAACAGCACCTGAGTCAGCCLF 22 61.07 -4.76 -5.84 0.50 CGTAGAGGCAAAAGAAAGTGGGLB 17 61.79 -6.19 -6.10 0.65 TGTCCGGGTCAGCCTGA2 待检品的准备待检品DNA抽提： Qiagen 司菌基“ DNA提取 盒（货号：5106）， 作说明，提取菌基“ DNA。Bio-Tek超微光光度
11、测定基“ DNA浓度（ 2）。表2 ：沙门菌基因组DNA浓度沙门菌菌株 沙门标准菌 沙门菌1256 沙门菌004浓度(ng/L) 313.773 355.114 381.1963 LAMP检测方法3.1 1 LAMP方法 LAMP反应 ：FIP BIP 08 mol/L，F B 01 mol/L，Floop Bloop 04 mol/L， NTPs（10mmol/L）5 L，甜菜碱（Betaine）08 mol/L，MgCl2（25mmol/L）6 L，10Bst DNA聚 酶缓冲液 25 L，Bst DNA聚 酶（8 U/L）1 L，DNA模板1 L， 蒸水至25 L。混匀，65反应40 m
12、in，80 10 min终止反应。12 000 r/min，”1 min，观察管 色沉淀。每管入1 000SYBR reen I 染料 l L，充混匀，观察颜色变 。绿色阳性，橙色阴性。 取 L扩增 物，15琼脂糖凝胶电泳检测。LAMP反应 束 ，12 000 r/min，”1 min，空 管无 色沉淀，基“ DNA 阳性粒 均 色沉淀（图1）。入染料，空 橙色，基“ DNA 阳性粒 呈绿色（图2）。电泳 果显示，基“ DNA 阳性粒 条带呈 梯状布（图）。5图1：检测方法 色沉淀图1：空 2：基“ DNA 3：阳性 粒pGEM-T-STN图2：检测方法 染料染色图1：空 2：基“ DNA 3
13、：阳性 粒pGEM-T-STN图3：检测方法 琼脂糖凝胶电泳图M：100bp ladder marker 1：空 2：基“ DNA 3：阳性 粒pGEM-T-STN3.2 检测方法的优 621 反应 间的优 （10min 20min 0min 40min 50min 60min）图4：反应 间优 染料染色图13：10min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 46：20min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 79：30min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1012：40min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1315：50min空 基“ DNA阳性
14、 粒pGEM-T-STN 1618：60min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN图5：反应 间优 琼脂糖凝胶电泳图M：100bp ladder marker 13：10min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 46：20min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 79：30min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1012：40min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1315：50min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1618：60min空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 设置10 min20 min0 min40 mi
15、n50 min 60 min 6 间梯度，反7应温度均65，80 10 min终止反应。65反应10 min 50 min，12 000 r/min”1 min，空 无沉淀，基“ DNA 阳性粒 均 生 色沉淀。入染料 ，空 橙色，基“ DNA 阳性粒 均变绿色（图4）。琼脂糖凝胶电泳检测 果 明，基“ DNA 阳性粒 梯状扩增条带（图5）。当反应延长至60min ，12 000 r/min”1 min，空 基“ DNA 阳性粒 管均 色沉淀 入染料 ，品均变绿色 琼脂糖凝胶电泳检测 果 明，空 出现扩增，呈弥散状布。 果 明，可选取40min作本研究 的沙门菌LAMP检测方法的fi佳反应 间
16、。22反应温度的优 （5 61 6 65 6 6）设置5616656 6 6 温度梯度，反应 间均40min。80，10 min终止反应。入染料 ，在56温度范围内，空 均橙色，基“ DNA 阳性粒 均变绿色（图6）。琼脂糖凝胶电泳检测 果显示，基“ DNA阳性粒 均呈现 梯状条带（图）。由Bst DNA聚 酶的fi适反应条件65，故选择65fi佳反应温度。图6：反应温度优 染料染色图13：59空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 46：61空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 79：63空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1012：65空 基“ DNA阳性 粒pGE
17、M-T-STN 1315：67空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1618：69空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 8图7：反应温度优 琼脂糖凝胶电泳图M：100bp ladder marker 13：59空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 46：61空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 79：63空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1012：65空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1315：67空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1618：69空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 2镁子浓度的优 （2 mM 4 mM
18、 6 mM 8 mM 10 mM 12 mM）图8：镁子浓度优 染料染色图13： 2mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 46： 4mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 79： 6mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1012： 8mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1315：10mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1618：12mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN9图9：镁子浓度优 琼脂糖凝胶电泳图M：100bp ladder marker 13： 2mmol/L空 基
19、“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 46： 4mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 79： 6mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1012： 8mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1315：10mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 1618：12mmol/L空 基“ DNA阳性 粒pGEM-T-STN 设置2mmol/L4mmol/L6mmol/L8mmol/L10mmol/L 12mmol/L 6 镁子浓度梯度，65反应40 min，80，10 min终止反应。入染料 ，镁子浓度2 mmol/L ，空 基
20、“ DNA 阳性粒 均橙色 镁子浓度410 mmol/L ，空 均橙色，基“ DNA 阳性粒 变绿色 镁子浓度12 mmol/L ，空 呈绿色（图8）。琼脂糖凝胶电泳 果与染料显色 果 ，镁子浓度12 mmol/L，空 非特异扩增，电泳呈弥散状（图）。 果 明，镁子浓度6 mmol/L ，电泳条带fi亮，故选择6 mmol/L作fi佳镁子浓度。24物浓度 的优 （1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 1:12）F B 01 mol/L，Floop Bloop 04 mol/L，设置外物：内物1:21:41:61:81:101:12 6 物浓度 梯度。镁子浓度6 mmol/L，65反应40 min，80 10 min终止反应。入染料 ，空 均橙色，基“ DNA 阳性粒 均变绿色（图10）。琼脂糖凝胶电泳 果与染料显色 果相（图11）。物浓度 达1:8 ，沉淀明显增多，故选外内物浓度 1:8作fi佳物浓度。10
