1、微生物思考题及参考答案1.用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比.2.什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清
2、晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 3.影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的 NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长.4.美蓝染色液作用时间的不同,对酵母菌死细胞数量有何影响,试分析原因答：会造成更多的死细胞，在显微镜下观察，活的是透明无色，衰老的是淡蓝色，死亡的是蓝色，如果美蓝染色液作用时间过长，会造成细胞脱水死亡并渗透染液，影响实验结果。5.镜检时如何区分放线菌基内菌丝，气生菌丝以及孢子丝一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。6.在进行细菌涂片时应注意哪些环节1、载玻片应该
3、冷却后再涂片。 2、如果是涂布液体，可以用毛细管或接种环滴一小滴，然后轻轻抹开，一圈足够。 3、如果是涂布菌落或菌苔，应该在载玻片上先滴一滴水，再将菌落或菌苔涂布上去，接种环的尖蘸一点点即可。 4、为了节省时间，可以将干燥和热固定合并成一步。但是应该避免高温，因为温度一高，细菌会变形。 5、染色时间视染色液种类而定。如结晶紫只需几十秒，亚甲基蓝则需一到两分钟。 6、冲洗时，水流不能太大，而且尽量避免水流直接冲在涂片上。 7、冲洗后干燥，可以用酒精灯加热以节省时间，同样的，应该避免高温，因为温度一高，细菌会变形。7.进行细菌制片时为什么要进行加热固定?在加热固定时应注意什么?固定的目的有三个：
4、1）杀死微生物，固定细胞结构。 2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。 3）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。 固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过 3 次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。8.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察1.因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.2、若未完全干燥，水滴会影响油与玻璃之间折光率，造成视野不够清晰。 9.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂
5、片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节。10.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：菌龄太老，细胞壁通透性改变。着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌。11.革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？ 革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱
6、色是应当控制速度，脱色时间一般为 2030s）。12.革兰氏染色中,哪个步骤可以省略?在什么情况下采用媒染目的是在所有的细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。 脱色后使革兰氏阴性菌变为无色。 复染使革兰氏阴性菌染成红色。 所以鉴别细菌的革兰氏阴阳性只须媒染，复染的目的是为了看清革兰氏阴性菌。13.你主要根据哪些形态特征来区分四种不同的霉菌 曲霉:具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端膨大成球状顶囊，表面辐射出一层或两层小梗，小梗上着生成串的球形分生孢子。分生孢子梗生于足细胞上，并通过足细胞与营养菌丝相连。 根霉:菌丝无隔、多核、分枝状，有匍匐菌丝和假根。在假根的上方直立
7、地生长出一至数根孢囊梗，其顶端膨大成球形孢子囊。囊的基部有囊托，中间有球形或半球形囊轴。毛霉:菌丝无隔、多核、分枝状，无假根或匍匐菌丝。菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。各分枝顶端着生球形孢子囊，无囊托。 青霉:菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙。基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体。孢子颜色：黑曲霉是黑色，青霉是青色，根霉是白菌丝黑孢子，毛霉则是淡黄色。以上为实验室观察1）菌丝特征：青菌与曲霉菌丝与膈；毛霉与根霉则无； 2）菌丝的特化结构：曲霉有足细胞，其它霉菌无；根霉有假根与匍匐枝，其它霉菌
8、无；3）孢子头特征：青霉的孢子头为扫帚状；根霉与毛霉的孢子头为囊状；曲霉为菊花状孢子头。14.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?目镜测微尺中每小格代表的实际长度是不固定的，它是随所使用目镜和物镜的放大率的不同而改变的，故在测量前必须先用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正，以得出在显微镜的特定放大倍率下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。15.在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答:相同;目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确等分的刻度，有把 毫米刻成为50 等分或把 10 毫米长度
9、刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微 镜放大后的细胞物象。由于在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定 同一细菌的大小时，物象的放大倍数与每小格目镜测微尺所代表的长度在变化比例上是同步的，故而测定结果相同。16.哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何避免?操作时没有先盖盖玻片再滴加悬液，导致体积不准确。避免：先盖盖玻片再滴加悬液。细胞密度太高。避免：稀释溶液。 溶液不均匀。避免：滴加溶液前混匀悬液。1、仪器误差：所用器材均应清洁干净，并且计数板计数区不应该有擦痕。 2、计数室内可能有气泡。因为酵母细胞并没有染色，看起来是透明的，有气泡很容易被计
10、入，使数值偏高；并且，气泡会影响菌悬液的随机分布。改进：若产生气泡，则用吸水纸吸出。 3、菌体在计数板上分布不均，当用选取 5 格计数时，会造成很大误差。改进：应使菌液自然流入并混匀，进行观察时尽可能多数几个格子。 4、配制稀释液时吸取的浓度过高或过低，导致稀释液浓度和原液不成正确比例，计算时产生误差。应将原液摇晃均匀后取中部的液体进行稀释。 5、由于数菌体数目时视觉疲劳而导致的视觉误差。应多人观察，取记录平均数。 6、计数时可能将格四周的菌都计算在内了，使数值偏高。 改进：谨遵一个规则，计上不计下，计左不计右，不可以重复计数。 7、可能出现有出芽的酵母菌，将出芽的酵母菌按两个计数了，使数值偏
11、高。 改进：计数时，只有当芽体于母细胞一样大的时候，才能计为两个。17.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是否无菌？为什么要倒置培养？ 答：由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长系列而消耗养分和改变培养基的酸碱度所带来的不利影响。 将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 2448h，无菌生长即可证明灭菌后的培养基无菌。 倒置培养的主要目的：1）由于重力的作用使培养基表面及次层能富集微生物生长所需的营养物质，利于微生物生长；2）防止空气中微生物的污染培养基及培养物：倒置时平板内
12、的空气是不流动的,杂菌不会沉降到培养基表面,如果不倒置,很快平板周边会长起杂菌。3）倒置培养使琼脂里水分不易蒸发出去，而充分的保持琼脂的弹性与细菌容易繁殖和生存的环境。如果不倒置，大概 3 天左右培养基就会出现龟裂等水分散失的情况。而一些落菌等试验，需验证培养基无菌，就要先倒置培养 48 小时才可作为模板做落菌，水分散失是很重要的。19.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？ 答：一般而言，培养基的配置要注意如下几点原则： 1）营养成分的配比：碳源和氮源的比例（C/N）要适当； 2）适宜的酸碱度（pH 值）：配制培养基时 pH 的调节； 3）渗透压：营养物质要有适合的浓度； 4）培
13、养基不能反复高温灭菌。 5) 称不溶性固形物时，应单独称，若量少的可以与无机盐一起称，但一定要混匀再分装； 6）一般情况下培养基用自来水配制。操作细节上则要注意：1）称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖 2）调 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度 3）分装时注意不要污染棉塞、试管口，以免染菌。 4）及时灭菌，以免培养基及容器里的微生物生长繁殖消耗养分、改变酸碱度。1、当然是注意浓度配比不要搞错2、很多培养基的加料顺序有讲究,否则会有沉淀产生3、有些培养基会有不溶物质,分装前应摇匀4、不要忘了调节 pH 值（一般细菌都需要,酵母可能自然 pH 就行,不过不一定）5
14、、加热溶解时尽量不要煮沸,会损失营养物质20.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物。 答：1）在使用高压蒸汽灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 2）压力未降至“0”便开盖取物的可能后果：压力锅内压力骤然降低，引起容器中的溶液喷出容器口导致污染或导致人员的烫伤。21.干热灭菌操作过程中应注意哪些问题为什么1、物品不要摆放太挤,以免妨碍空气流通2、灭菌物品不要接触干燥箱内壁的铁板,以防包装纸烤焦起火3、
15、灭菌时人不能离开4、灭菌结束后不能忘记关掉电源5、待温度降到 70 度以下再打开,否则冷热空气交替,玻璃器皿容易炸裂或发生烫伤事故22.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高 时间长？ 在湿热条件下，有水蒸汽的作用： a 高温水蒸汽导热比干空气要快； b 高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程； c 高温水蒸汽能穿透细菌的细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞； d 高温水蒸汽能水解一部分细胞结构，加速导热。 （湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的穿透力比干热大；湿热的蒸汽有潜热存在，每 1 克水在 100时，由气态变为液态时可放出 226kJ（千焦）的热量。这种潜
16、热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。） 23.设计实验方案，比较干热灭菌和湿热灭菌的效果。 以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件和等量原则。 （一） 实验材料 试管 镊子 酒精灯 嗜热脂肪芽孢杆菌 ATCC 7053 菌片 纸片（与菌片同大小 同材料）溴甲酚紫蛋白冻水培养基（已灭菌）等实验材料（材料有余）。 （二） 对照组 取 9 支洁净试管，分为 A1 B1 C1 三组（每 3 支一组），将 A1 组中放入菌片，B1 组中放入纸片，C1 组中什么也不加；不经灭菌，直接加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）。 （三） 恒为培养 将上述所有试管按分组在 56恒温条件下培养 48 小时
17、。24.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养请写出实验的主要步骤纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。25.配制牛肉膏蛋白胨培养基，有哪些操作步骤？那几步易出错，如何防止？ 称取药品加热溶化分装加棉塞包扎灭菌搁置斜面 易出错的步骤有： a 称取药品 称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水的药品要快速称取； b 加热溶化 加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底（在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。）；c 分装 分装时培养基不能粘在三角瓶（
18、或试管）口，以免接种时染菌； d 搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜。26.平板菌落计数法的原理是什么? 它适用于那些微生物的计数？ 平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的 23 或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位）。 平板计数法是根据微生物在固体培养基上
19、所形成的一个菌落是由一个微生物繁殖而形成的现象进行的，也就是一个菌落可代表一种微生物（并不绝对)。通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。8、微量移液器的最小量程太大，在加样时，容易加多，使盖玻片鼓起，血球计数板所技术的体积变大，最终结果偏大。 改进：用量程的小的微量移液器并少加一些。27.如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？写出实验方案（产蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）。以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件 一 材料准备 1 土壤【有机质（特别是蛋白质）含量丰富的土壤】 2 灭菌生理盐水（0.85%NaCl） 3
20、灭菌移液管 4 添加酪素的 B4（牛肉膏蛋白胨完全培养基）经灭菌 5 B4 斜面（经灭菌） 6 其他材料：接种环 酒精灯等 二 操作方法 1 在盛有 10ml 灭菌生理盐水的烧杯中添加 1g 土壤，配成悬浮液； 2 稍静止后，用灭菌移液管移取部分上清液，将其制成 104106 倍的稀释液； 3 用灭菌移液管吸取各稀释液用稀释倒平板法（或涂布平板法）将其接入添加酪素的B4 平板上； 4 在 5565下培养 12 天； 5 挑取形成降解酪素透明圈的菌落（透明圈直径 D 与菌落直径 d 之比较大者），转接入 B4 斜面上培养；（若无特定菌落形成，则需另取土样从开始重复试验） 6 将 B4 斜面上的菌
21、落再用平板纯培养，依次重复 23 次后即可得到纯培养（镜检）； 7 纯培养细菌中蛋白酶的提取及活性鉴定【摇瓶培养（若提取蛋白酶及其活性正常，则纯培养成功，否则，重取土样重复以上实验）】。28.为什么熔化后的培养基要冷却至 45左右才能倒平板？低于这个温度琼脂会凝固，温度过高，如果是做倾倒琼脂做菌落计数，会杀死一部分细菌，如果只是只是制备琼脂平板，那么温度太高就进行倾倒会导致琼脂凝固后偏软，水汽过多。29.要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？1 无菌操作 2 稀释良好，不会太浓或太稀。 3 菌落生长时间控制好，不会长的太大不便区分，也不至于太小影响计数。30.当你的平板上长出的菌落
22、不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？1.太浓 2.没涂匀31.用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？倾注法是在培养皿中接种好样品之后，倾注琼脂并培养；而涂布法则是在琼脂表面接种并使用 L 型棒涂布。因此，倾注法的菌落将出现在琼脂的各个部位，包括底层和中层，但涂布法培养后形成的菌落只出现在琼脂表面。32.你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 答：淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要高耗能的胞吞作用。因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效。 试验中出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌产
23、生的胞外的淀粉酶起的作用。 33.不利用碘液，你能否证明淀粉水解的存在? 答：由于淀粉水解生成葡萄糖，即多羟基醛，因此可利用醛的性质进行检验，如银镜试验，斐林试验等。呈阳性者，说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。34.假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？ 答微生物有氧代谢葡萄糖产气不产酸，因此发酵结果是小管中生气泡但是溶液不变黄。35.解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？ 答：化学原理：有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 因为丙酮酸是生物体呼吸作用的产物，无论是有氧还是无氧，都会产生丙酮酸，因而
