1、倒置荧光显微镜操作规程Olympus IX5厦门大学医学院中心实验室黄静茹2017 年 3 月说明：透射光主开关；汞灯高压电源开关；透射光光强控制钮；滤色片架；光路选择杆；X 轴和 Y 轴调节钮；物镜转盘；粗/微调焦旋钮；双目观察筒；屈光度调节环；聚光镜高度调节钮；聚光镜对中旋钮；视场光阑调节杆；孔径光阑调节杆；聚光镜转盘；荧光光闸（SHUTTER） ；荧光激发块转盘；荧光减光阀正式操作仪器之前请注意如下事项：首先要在仪器预约保护时间内及时使用本人注册的校园卡刷卡开始实验。1. 查看仪器使用记录本，如之前使用者有记录仪器异常情况，请不要开机使用。2. 查看仪器整体有无异常，周围环境是否正常，需
2、要时要开启室内空调，检查并清空除湿机水箱。3. 查看仪器使用记录本及刷卡机“日历” ，如之前使用者刚刚关机，请等候 30分钟以上再开机使用。一、开机1、 打开透射光源（白光）主开关；2、 打开荧光光源（汞灯高压电源）；3、 打开电脑，进入 cellSens Standard 工作站； 备注：标本为 HE 染色、免疫组化时，不需要打开荧光光源；标本为荧光染料染色时，一般也不需要打开白光光源。二、明场观察（Bright Field BF）1、正确放置标本，BF 主要用于 HE 染色、免疫组化标本；2、转动荧光激发块转盘到“6”的位置；3、转动聚光镜转盘到“BF”位置，直到听到咔嗒声；4、将光路选择
3、杆推进去（ 选择目镜观察光路） ；5、转动物镜转盘，选用合适的物镜，调节白光光强控制钮至合适的强度， 调节粗/细调焦旋钮聚焦观察,根据需要调节瞳间距和屈光度；三、相衬观察（Phase contrast PH)1、正确放置标本，PH 主要用于没有任何染色的、较透明的标本；2、转动荧光激发块转盘到“6”的位置；3、转动物镜转盘，选用合适的物镜；4、转动聚光镜转盘，使相衬光学元件与所用物镜相匹配（见表 1） ；5、将光路选择杆推进去（ 选择目镜观察光路） ；6、调节光强控制钮直至合适的强度，调节粗/细调焦旋钮进行聚焦观察,根据需要调节瞳间距和屈光度。表 1： 物镜、相差元件匹配表物镜 4X 10X、
4、20X 40X相差元件 PHL PH 1（PH C） PH 2四、荧光观察1、如果需要，可先用明场观察对标本定位，再转入荧光观察；2、如果不再需要 BF 观察，可关闭白光电源；或将白光光强调节钮逆时针旋至最低，将孔径光阑向右拨至最小；3、转动荧光激发块转盘，根据所用的荧光染料选择匹配的荧光激发块；表 2：荧光激发块序号 激发块名称 激发光（nm）发射光（nm）滤掉光（nm）1 WU 330-385 420 4002 WB 450-480 515 5003 WG 510-550 590 5704 WBV 400-440 475 4555 WIY 545-580 610 6006 BF 明场、相差
5、4、打开荧光光闸（SHUTTER） ，使其置于“O”位置； 5、将光路选择杆推进去（ 选择目镜观察光路） ；6、转动物镜转盘，选用合适的物镜，调节粗/细调焦旋钮聚焦观察，根据荧 光强度选择合适的 ND 滤镜（荧光减光阀）进入光路。 （第一个ND100：100% 的荧光强度进入光路；第二个 ND6：6%的荧光强度进入光路，第三个 ND25: 25%的荧光强度进入光路） 。五、CCD 成像1、cellSens Standard 工作站中，,点击右侧摄像控制中的实时观察；2、将光路选择杆拉出（ ，CCD 成像光路） ，调节粗/细调焦旋钮进行聚焦；3、曝光：可先选择自动曝光，参照自动曝光时间，再通过手
6、动调节曝光时间使图像更清晰；4、背景校准：进行明场和相差成像时执行白平衡 ，荧光成像时执行黑平衡， 在样品空白背景处画一个小区域，软件自动以该处为背景对整幅图像进行调整，使所选区域显示为白色或黑色；5、各成像参数设定完毕后，点击拍照 ，仪器自动成像；6、右键文档工具栏窗口或在文件处进行保存（TIF 或 JPG 格式） 。六、图像处理1、标尺：在工具栏上选择正确的物镜倍数，点击“视图”-标尺，软件自动将标尺加在图像上，再点击“图像”-印入信息，保存即可。2、测量：点击“测量”-测量工具，软件左侧显示出测量工具栏，点击选择所需的测量工具，在图像上画目标区域，右键点击结束测量即可显示结果。 测量结果
7、可导出 Excel：点击测量工具栏图标 。3、图像叠加：打开拟叠加的图， “图像”-组合彩色图像-“可用图像”中选择拟叠加的图-合并层-确认。4、图像拼接：按一定顺序 拍摄图像，相邻两张图像的边缘要部分重叠，所有图像拍摄完毕后，选择视图-工具-画廊-全选拟拼接的图像，选择运算-图像拼接-设置水平方向图像数量-根据拍摄顺序摆好图像位置-确定；预览后视情况选择“裁剪边缘”-确定。七、关机1、关机前请查看放在实验台上的刷卡机“日历” ，如紧接着有其他人员将使用该仪器，无需关机，联系后面使用者。2、实验完毕，先退出工作站；3、将透射光光强调节钮逆时针旋至最低，关闭透射光主开关（TH4）；4、确认汞灯开
8、启超过 0.5h，方能关闭汞灯高压电源；5、用无水乙醇擦拭镜头，并将物镜转盘转至空位，清理载物台及桌面；6、数据上传：将待上传的实验结果文件夹添加为压缩包，再将其复制到桌面上的“云存储文件夹”中。7、关电脑及显示器。八、注意事项1、汞灯开启后必须至少使用 0.5h 才能关闭！汞灯关闭后若还需使用，必须等0.5h 后才能再次开启！2、软件上如果没有显示“摄像控制” ，通过以下方式调出：视图-工具窗口-摄像控制。3、在使用 20X 和 40X 物镜时，如不能清晰聚焦，先检查玻片是否清洁，放置是否正确，再边转动物镜上的校正环，边聚焦，找到最佳校正位置。离开实验室之前切记要及时使用本人注册的校园卡刷卡结束实验。
