1、银杏叶提取物 EGB 对 CCl4肝损伤小鼠的 MDA 含量以及 SOD 活力的影响学生：杜改亮 指导教师 ：刘春卉 （太原师范学院生物系 20061312 班,学号：2006131201,山西太原 030031）摘要 目的：探讨银杏叶提取物 EGB( 黄酮类) 对 CCl4 肝损伤小鼠以 MDA 含量及 SOD 活力的影响，生产出一种有效保护肝脏的药物。方法： 清洁级昆明种小鼠 兼用， 随机分为空白对照组、吐温对照组、模型对照组、联苯双酯阳性对 照组、 实验组（银杏叶提取物低 浓度、银杏叶提取物中浓度、银杏叶提取物高浓度），用四氯化碳皮下注射法建立慢性肝 损伤模型，分别用生理盐水或药物灌胃治
2、疗。检测肝组织中脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力并加以探讨。结果：EGB 能显著升高 CCl4 所致急性肝 损伤小鼠其 SOD 活力，并可 显著降低 该模型小鼠肝组织中 MDA 的含量。 结论：银杏叶提取物( 黄酮类 )对此模型小鼠的肝损伤具有显著的保护作用，可能与降低、抑制脂质过氧化反应以及抗自由基损伤有关.关键词 银杏叶提取物; CCl 4 肝损伤小鼠; MDA 含量；SOD 活力 近几年来由于大量有害物质的产生，人们可能在不经意间，接触大量有害物质，例如 CCL4, CCL4致急性中毒性肝炎、肝中毒四氯化碳进入肝细胞后，使线粒体膜的脂质溶解，从而影响线粒
3、体的结构和功能，使酶蛋白质的合成减少，造成酶的破坏，因而影响代谢功能和能量的合成，致死。新观点认为细胞坏死的关键是由于四氯化碳抑制了细胞膜上钙泵活性，大量钙离子内流，堆积于细胞内的结果。此种动物模型可观察到急性肝炎的糖、脂肪、胞色素等方面的代谢障碍、肝解毒功能障碍，磺溴酚纳滞留血清，转氨酶明显升高，迅速出现营养不良、肝脂肪化变性及坏死等形态学变化。肝小叶中央坏死和肝细胞脂肪变性是其主要病变。有一种阳性药联苯双酯，它是一种治疗肝炎的降酶药物，即可减轻因 CCL4所致的肝脏损害，对CCL4 所致的肝脏微粒体脂质过氧化，CCL 4代谢为 CO 有抑制作用，对肝脏具有保护作用，虽治疗肝脏的药物很多，但
4、效果不是很好。近几年国内外学者对银杏叶药理进行了大量的研究，银杏（ Ginkgo biloba）系银杏科银杏属落叶乔木，为中生代孑遗的稀有物种，被称为被子植物的“活化石”是我国特有植物。20 世纪以来，发现其主要药用成分为黄酮类和萜内酯类化合物。药理试验表明银杏黄酮类化合物有使冠状血管及其他血管扩张的作用。银杏黄酮有抗自由基、抑制脂质过氧化作用。可直接清除 02一 、.OH 一 ，捕捉脂化自由基、脂氧自由基和烷自由基等，通过对这些自由基起一种氢原子供用而终止自由基连锁反应链，从而阻止和抑制氧自由基反应和脂质过氧化的病理性加剧，减轻氧自由基和脂质过氧化损伤。推测 EGB 对肝损伤也有保护作用。本
5、实验就是通过设计一系列的对比实验，研究 EGB是否确实有此作用。1 材料与方法1.1 实验材料- 1 -1.1.1 药物1.1.1.1 银杏叶提取物（黄铜类） 江苏同源堂生物工程公司 批号：老师帮填一下 临用时用 0.1%吐温80，蒸馏水配制成 10mg/kg，40,mg/kg， 160 mg/kg 低中高三个浓度。1.1.1.2 联苯双酯（15mg/丸） 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 批号：080603临用时用蒸馏水配制成 0.12%混悬液取 80 丸*15mg/丸=120mg （120mg100ml 水=0.12%）1.1.1.3 CCl4 北京化工厂提供 批号：080121 临用前用大
6、豆油制成 0.1%的四氯化碳油溶液。1.1.2 试剂ALT 试剂盒 批号：20100316；AST 试剂盒 批号：20100317；SOD 试剂盒 批号：20100317；MDA 试剂盒 批号：20100317，均为南京建成生物工程研究所生产。总蛋白测定试剂盒 北京北化康泰临床试剂有限公司 批号：20091028 1.1.3 实验动物小白鼠 清洁级昆明种兼用，体重 24+2g，北京医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（京） 2004-00011.1.4 仪器1.1.4.1 电子称：ACS-A-JJ 交直流电子计价秤，中航第一集团太原航空仪表有限公司生产。1.1.4.2 721 分光
7、光度计，上海第三分析仪器厂生产。1.1.4.3.HH-60 数显恒温搅拌水箱，苏州威尔实验用品有限公司生产。1.1.4.4 FZQ-2 型漩涡混合器，竞速泰县医疗器械厂1.1.4.5 电子天平，BP310P 德国赛多利斯生产。1.1.4.6 离心机（KDC-1044 低速离心机），科大创新股份有限公司中佳分公司生产。1.2 实验分组与处理1.2.1 分组1.2.1.1 空白对照组1.2.1.2 0.1%吐温对照组1.2.1.3 模型对照组1.2.1.4 联苯双酯阳性对照 300mg/kg 1.2.1.5 银杏叶提取物低浓度 10mg/kg1.2.1.6 银杏叶提取物中浓度 40mg/kg1.2
8、.1.7 银杏叶提取物高浓度 160mg/kg1.2.2 处理3 月 15 日，随即分为七组后，灌胃给药（0.25ml/10g 体重） ，空白对照组、模型组给予等量蒸馏水，吐温对照组给予等量吐温，连续灌胃七天，灌胃前称一次体重，灌胃后第二天再次称重，然后第四天三次称重，称重后，除空白对照组及吐温对照组外，各组动物均腹腔注射 0.1%CCl4溶液 10ml/kg（取CCl430l30ml 大豆油） ，第七天灌胃给药后停食。16 小时后解剖取出肝脏、脾。1.3 称肝脏、脾脱臼处死小鼠，剖取肝脏、脾称重。1.4肝组织中脂质过氧化指标及抗氧化活性的测定 1.4.1 MDA 含量测定方式MDA 含量测定
9、方式是在国内外众多测试方法的基础上改进的一种微量、快速、简便、准确、对操作人员健康无损害的测试方法。通过测试可反映出血清（浆） 、乳汁等细胞外液、红细胞、白细胞、培养细胞以及各种动植物的细胞水平及亚细胞水平的脂质过氧化物的量。1.4.1.1 丙二醛（MDA）的测定意义：- 2 -机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（PUFA） ，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如：醛基（丙二醛 MDA） 、酮基、羟基、羰基、氢过氧基可内过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不公把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，
10、放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸（PUFA ）的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而测试 MDA 的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。MDA 的测定常常与 SOD 的测定相互配合，SOD 活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA 的高低又间接的反应了机本细胞受自由基攻击的严重程度，通过 SOD 与 MDA 的结果分析有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。1.4.1
11、.2MDA 试剂盒测试原理：过氧化脂质降狗解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm 处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥（TBA）所以此法称 TBA 法。1.4.1.3 测试所需仪器设备可见光分光光度计，可调到 95左右的恒温水浴箱（或者铝锅内放几个去掉盖子的易拉罐，将罐壁及底部穿数十个孔，以便水的进入，用来代替水浴箱。 ） ，离心机。1.4.1.4 100T 试剂盒组成与配制1.4.1.4.1 试剂一：液体 20ml1 瓶，室温保存。 （天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用） 。1.4.1.4.2 试剂二：液体 12ml1
12、 瓶，用时每瓶加 340ml 双蒸水混匀，4冷藏（注意不要碰到皮肤上）。1.4.1.4.3 试剂三：粉剂1 支，用时将粉剂加入到 90-100的热双蒸水 60ml 中， （在溶解过程中可适当加热） ，充分溶解后用双蒸水补足至 60ml 再加冰醋酸 60ml，混匀，配好的试剂避光冷藏。 （冰醋酸自备注）1.4.1.4.4 标准品：10nmol/ml 四乙氧基丙烷 5ml1 瓶，4冷藏。测试盒冷藏至少可保存一年。注：冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购 AR 级即分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为 99%以上。1.4.1.5 50T 试剂盒组成与配制：1.4.1.5.1 试剂一：液体
13、10ml1 瓶，室温保存。 （天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用） 。1.4.1.5.2 试剂二：液体 6ml1 瓶，用时每瓶加 340ml 双蒸水混匀，4冷藏（注意不要碰到皮肤上） 。1.4.1.5.3 试剂三：粉剂1 支，用时将粉剂加入到 90-100的热双蒸水 30ml 中， （在溶解过程中可适当加热） ，充分溶解后用双蒸水补足至 30ml 再加冰醋酸 30ml，混匀，配好的试剂避光冷藏。 （冰醋酸自备注）1.4.1.5.4 标准品：10nmol/ml 四乙氧基丙烷 5ml1 瓶，4冷藏。测试盒冷藏至少可保存一年。注：冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司
14、均有售，要购 AR 级即分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为 99%以上。1.4.1.6 规范操作方法：1.4.1.6.1 操作表：标准管 标准空白管 测定管 测定空白管- 3 -10nmol/ml 标准品（ml） 0.1无水乙醇（ml） 0.1测试样品（ml） 0.1 0.1试剂一（ml） 0.1 0.1混匀（摇动几下试管架）试剂二（ml） 3 3 3 3试剂三（ml） 1 1 150%冰醋酸 1旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95水浴（或用锅开盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却，然后 3500-4000 转/分，离心 10 分钟， （3000 转/分以下离心时间需延长，目的使
15、沉淀完全） 。取上清 0.1ml，532nm 处，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管的吸光度值。1.4.1.6.2 参考取样量：血清（浆）取 0.1-0.2ml。低密度脂蛋白悬液取 0.1-0.2ml。食油取 0.03ml,肝组织、心肌、肌肉组织、螺旋藻等，取 5%或 10%匀浆 0.1-0.2ml 较好。1.4.1.6.3 规范操作方法标准管吸光度：当标准品取样量为 0.1ml 时，则标准管吸光度减去标准空白管的吸光度为 0.065-0.070。当标准品取样量为 0.2ml 时，则标准管吸光度减去标准空白管的吸光度为 0.130-0.140。1.4.1.6.4 规范操作方法及简便操作方法中，若
16、发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间 40 分钟延长至 80 分钟，但您的同一课题中 MDA 的检测都必须延长至 80 分钟，以免造成批间差异。1.4.1.6.5 计算公式：血清（浆）中 MDA 含量计算公式：血清（浆）中 MDA 含量 测定管吸光度-测定空白管吸光度 （nmol/ml） = -标准品浓度 样本测定前标准管吸光度-标准空白管吸光度 （10nmol/ml） 稀释倍数组织中 MDA 含量计算公式：测定管吸光度-测定空白管吸光度 组织中 MDA 含量 = 标准品浓度 蛋白含量（nmol/mgprot） 标准管吸光度-标准空白管吸光度 （10nmol/ml） （mgprot/ml）n
17、mol/mgprot 为纳摩尔/毫克蛋白取上清100l,测定MDA含量。1.4.2 SOD活力的测定方法1.4.2.1 100管试剂盒的组成与配制：1.4.2.1.1 试剂一：贮备液：10ml1 瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用） ；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至 100ml，4保存 6 个月。1.4.2.1.2 试剂二：液体 10ml1 瓶，4保存 6 个月。1.4.2.1.3 试剂三：液体 10ml1 瓶，4保存 6 个月。1.4.2.1.4 试剂四：液体 350ul2 支，4保存不可冷冻；4 号稀释液 10ml1 瓶，4保存 6 个月。 用时两者按 1：
18、14 稀释，需多少配多少。配好的试剂四 4保存，不可冷冻。- 4 -注：所用吸嘴为一次性吸嘴。1.4.2.1.5 试剂五：粉剂1 支，用时加 70-80热双蒸水 75ml 溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至 75ml，配好后试剂避光 4冷藏 6 个月。1.4.2.1.6 试剂六：粉剂1 支，用时加蒸馏水 75ml 溶解后备用，配好后试剂避光 4避光冷藏 3 个月。显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3：3：2 的体积比配显色剂，4避光冷藏 3 个月。1.4.2.2 50 管试剂盒的组成与配制：1.4.2.2.1 试剂一：贮备液：5ml1 瓶（天冷时或放冰箱会有部分
19、析出，需热水浴溶解后再用） ；试剂一应用液的配制：用时加蒸馏水稀释至 50ml，4保存 6 个月。1.4.2.2.2 试剂二：液体 5ml1 瓶，4-10保存 6 个月。1.4.2.2.3 试剂三：液体 5ml1 瓶，4-10保存 6 个月。1.4.2.2.4 试剂四：液体 350ul1 支，4保存，不可冷冻；4 号稀释液 5ml1 瓶，4保存 6 个月。用时二者按 1：14 稀释，需多少配多少。配好的试剂四 4保存，不可冷冻。注：所用吸嘴为一次性吸嘴。1.4.2.2.5 试剂五：粉剂1 支，用时加 70-80蒸馏水 37.5ml 溶解后备用，若加热过程中水分 蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至
20、 37.5ml，配好后的试剂避光 4冷藏保存 6个月。1.4.2.2.6 试剂六：粉剂1 支，用时加蒸馏水 37.5ml 溶解后备用，配好后试剂避光 4冷藏保存 6 个月。显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3：3：2 的体积比配显色剂，4避光冷藏 3 个月。1.4.2.3 总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的测定1.4.2.3.1 操作总 SOD（T-SOD）活力的测定：试剂（ml） 测定管 对照管试剂一(ml) 1.0 1.0样品(ml) 0.05蒸馏水(ml) 0.05试剂二(ml) 0.1 0.1试剂三(ml) 0.1 0.1试剂四(ml) 0.1 0.1用旋涡混匀器充分混匀，置
21、37恒温水浴 40 分钟显色剂(ml) 2 2混匀，室温放置 10 分钟，于波长 550nm 处，1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，比色。1.4.2.3.2 计算：1.4.2.3.2.1 血清（浆） 、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总 SOD 活力计算：(1)定义：每亳升反应液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个 SOD 活力单位（U） 。(2)血清（浆） 、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总 SOD 活力计算公式：总 SOD 活力= 对照管吸光度-测定管吸光度 反应体系的 样本测试前的（U/ml） -50% 稀释倍数 稀释倍数对照管吸光度 1.4.2.3.2.2 组织
22、匀浆中总 SOD 活力计算：- 5 -(1)定义：每毫克组织蛋白在 1ml 反应液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个 SOD 活力单位（U） 。(2)计算公式：组织匀浆中 SOD 活力 对照管吸光度-测定管吸光度 反应液总体积 （U/ml） = -50%-组织中蛋白含量 对照管吸光度 取样量 （mgprot/ml）取100mg肝脏加1ml生理盐水，研制匀浆，离心3000转，20分钟，取上清30l，测定SOD的活力；2结果2.1体重、肝重及脾重组别大号编号体重（g)3.16体重（g)3.18体重（g)3.21 肝重（g） 脾重(g)1 1 25 25 25 0.964 0.
23、064 2 2 17 18 22 0.741 0.093 3 3 27 27 31 0.991 0.121 4 4 24 24 26 0.970 0.102 5 5 15 17 19 0.646 0.055 6 6 25 26 26 1.020 0.068 7 1 26 28 29 0.874 0.099 8 2 23 26 29 1.067 0.116 9 3 31 32 34 1.256 0.195 10 4 25 29 33 1.250 0.154 空白对照11 5 28 31 33 1.190 0.113 12 1 26 26 29 1.077 0.098 13 2 25 24 25
24、0.858 0.106 14 3 16 18 21 0.735 0.061 15 4 23 24 24 0.865 0.080 16 5 16 18 20 0.767 0.081 17 6 21 23 26 0.908 0.053 18 7 23 20 19 1 31 33 35 1.420 0.126 20 2 22 26 27 1.116 0.150 21 3 30 33 36 1.383 0.092 22 5 29 31 33 1.126 0.089 23 1 25 25 26 1.007 0.106 吐温对照 24 2 22 24 25 0.990 0.038 25 3 23 24 2
25、4 0.898 0.112 26 4 27 28 30 1.070 0.130 27 5 24 24 24 0.905 0.052 28 6 21 23 25 1.195 0.214 29 1 30 33 36 1.439 0.142 模型对照30 2 28 29 29 1.129 0.054 - 6 -31 3 29 31 34 1.492 0.172 32 4 24 26 27 1.034 0.075 33 5 27 28 29 1.377 0.126 34 1 23 24 25 1.078 0.097 35 2 25 24 26 1.095 0.167 36 3 19 21 22 0.9
26、11 0.055 37 4 22 23 22 0.806 0.048 38 5 22 23 22 0.833 0.045 39 1 25 28 30 1.144 0.122 40 2 28 29 31 1.798 0.092 41 3 28 30 31 1.428 0.199 42 4 30 33 34 1.270 0.129 43 5 27 29 30 1.414 0.133 44 1 24 23 24 0.831 0.145 阳性对照45 2 25 25 25 0.977 0.114 46 3 24 26 27 0.820 0.082 47 4 25 24 27 1.004 0.081 4
27、8 5 24 25 27 0.911 0.085 49 6 27 26 27 1.142 0.099 50 1 27 29 30 1.134 0.098 51 2 24 26 28 1.052 0.084 52 3 27 29 29 1.162 0.073 53 4 24 25 26 1.176 0.142 54 5 25 27 28 1.208 0.081 55 1 23 24 23 0.884 0.044 银低56 2 21 24 26 0.972 0.098 57 3 25 26 26 1.126 0.156 58 4 23 23 24 0.824 0.073 59 5 23 25 26
28、 1.039 0.107 60 1 30 31 32 1.251 0.101 61 2 29 30 30 1.195 0.101 62 3 24 25 26 1.120 0.087 63 4 26 28 29 1.094 0.109 64 5 30 30 32 1.087 0.111 65 6 25 28 30 1.129 0.093 66 1 25 27 27 1.140 0.194 银中 67 2 23 19 20 0.924 0.122 68 3 28 27 27 1.081 0.141 69 4 24 27 27 0.925 0.089 70 5 23 24 24 0.921 0.10
29、2 银高 71 1 30 32 34 1.393 0.149 - 7 -72 2 25 26 29 1.281 0.120 73 3 22 25 28 1.170 0.128 74 4 22 24 25 1.376 0.097 75 5 26 29 29 1.207 0.115 76 6 26 28 30 1.366 0.138 2.2 小鼠肝组织中 MDA 含量的变化性别 组别 剂量 MDA(nmolmg protein-1)空白 2.710.15吐温 0.1%Tween-80 2.051.15模型 6.122.83,*阳性药 30 mgkg-1 3.141.3210 mgkg-1 1.89
30、0.8340 mgkg-1 1.881.29雌GP160 mgkg-1 1.440.50空白 1.850.49吐温 0.1%Tween-80 1.870.48模型 3.051.85阳性药 30 mgkg-1 2.541.3910 mgkg-1 1.820.2440 mgkg-1 1.270.32雄GP160 mgkg-1 2.321.13EGB 对 CCl4致急性肝损伤小鼠肝脂质过氧化产物的影响(n=5)Effect of GP on lipid peroxidation (MDA) of hepatic tissue in mice with CCl4-induced injuries. (
31、n=5)注：为与空白对照组比较 P24%，含菇内酷6%，符合 EGB 的质量标准。研究发现，本实验在 CCL4腹腔注射同时给予小鼠按 EGB10mg/kg、40mg/kg、160mg/kg 灌胃，对CCL4腹腔注射引起的肝损伤有保护作用，可使肝组织中丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量降低，SOD活力升高，且 EGB 对肝损伤的保护作用与剂量正相关。EGB 应用安全，长期应用未见明显副作用。较单纯给予 CCL4腹腔注射的小鼠明显减轻。目前,研究发现几乎所有的临床和实验性慢性肝病中均发现氧化应激存在,且常伴有抗氧化能力降低,如过氧化脂质积聚,抗氧化酶活性下降,因此,脂质过氧化被认为
32、是发生肝脏炎性损伤的主要原因，而抗氧化剂治疗可预防(减轻) 这种症状。本实验中CCl 4诱导的慢性肝损伤小鼠肝组织中 SOD活性明显降低,MDA 含量明显升高,但银杏叶提取物( 黄酮类) 预防组SOD 活性明显升高,MDA 含量明显降低,说明银杏叶提取物( 黄酮类)对肝脏的保护作用可能与其抗氧化性有关。银杏叶提取物 ( 黄酮类)中的主要成分是黄酮甙,其母核中含有还原性羟基功能基团,捕捉脂质过氧自由基、脂氧自由基和烷自由基等 ,通过对这些自由基起一种氢原子供体的作用而终止自由基连锁反应链,从而阻止和抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应的病理性加剧,减轻氧自由基和脂质过氧化损伤。结合本文结果 ,我们认为银杏叶提取物( 黄酮类)是一个很有前景的保肝药物,值得进一步深入研究开发。结论1.小鼠以CCL 4腹腔注射1周，肝组织中MDA含量升高，SOD活力下降，同时改善肝功能。2.连续使用EGB对肝功能和肝脏结构无明显影响;3.EGB可抑制CCL 4腹腔注射所致的细胞膜脂质过氧化，EGB长期应用可能提高大鼠肝脏抗氧化功能;参考文献:1徐书云，广如濂，陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社,2002年1月第三版:1347.2于文涛等. 银杏叶提取物预防大鼠酒精性肝损伤的机制研究.学术期刊营养学报. 2005年2期.
