1、河南农业大学牧医工程学院 2011 届动物医学专业毕业论文1Real-time qPCR 检测鸡胚中贝氏隐孢子虫方法研究郭官鹏（2011届动物医学专业3班）摘要：为检测鸡胚中贝氏隐孢子虫，本研究根据 GenBank 公布的贝氏隐孢子虫和原鸡 18S rRNA 基因序列设计针对贝氏隐孢子虫的特异性引物，并以标准基因 组 DNA 为模板，建立贝氏隐孢子虫 SYBR Green 实时荧光定量 PCR（Real-time qPCR）方法，并对 含有贝氏 隐孢子虫的鸡胚尿囊液 样品进行检测。 结果表明，建立的 SYBR Green Real-time qPCR 方法可特异性扩增出贝氏隐孢子虫，而且建立的
2、标准曲 线线性关系良好(R 2=0.998)。进 一步做重复性结果显示试验重现性较好。本研究建立了快速、特异的定量检测鸡 胚中贝氏隐孢 子虫 Real-time qPCR 方法，可用于对贝氏隐孢子虫在鸡胚中繁殖规律分析和药物筛选评估。关键词：Real-time qPCR；贝氏隐孢 子虫；鸡胚Establishment of a SYBR Green Real-Time qPCR Assay for Detection of Cryptosporidium Baileyi in chorioallantoic membraneGUO Guan-peng(Class 3 of Veterinary
3、 Medicine, Graduated in 2011)Abstract：In order to detect Cryptosporidium baileyi in allantoic fluid, Real-time qPCR method was established with primers designed according the C.baileyi and chicken 18S rRNA from GenBank.This method was validated on allantoic fluid samples including C.baileyi. The res
4、ults showed that amplification of DNA from the C.baileyi were detected, others were not(C. andersoni; chorioallantoic membrane; chick embryo tracheal; Eimeria tenella; Escherichia coli ). Standard curves of Real-time qPCR was precise (R2=0.998). In summary, a rapid and specific Real-time qPCR method
5、 for the detection of C.baileyi in allantoic fluid samples has been developed, which could be served as a valuable tool for evaluating production and assessing potential drug of C.baileyi in chicken embryo.Key words: Real-time qPCR ; Cryptosporidium baileyi; Chicken embryo隐孢子虫(Cryptosporidium )是寄生于人
6、和动物胃肠道和呼吸道上皮细胞内能引起人畜共患隐孢子虫病(cryptosporidiosis)的一种原虫 1。现今，包括中国在内，在世界 6 大洲 90 个国家 300 多个地区已发现隐孢子虫，其能感染包括人在内的 240 多种动物 2。对于免疫功能正常宿主，其主要引起自限性腹泻。对于免疫抑制患者，尤其是获得性免疫缺陷综合症（AIDS）患者，感染后危害严重，且常常引起死亡 3。贝氏隐孢子虫（C. baileyi）为感染鸡的优势种，主要寄生于鸡喉头、气管、法氏囊和泄殖腔等部位，可引起雏鸡呼吸道症状，导致生产性能下降甚至死亡；当与其它免疫抑制性病原混合感染时，将造成更严重的经济损失 4。世界上大多数
7、国家均有鸡隐孢子虫病的报道，美国乔治亚州蛋鸡群感染率为1060，肉鸡群为 41；苏格兰鸡群感染率为 88 5。在我国，不同地域报道的鸡隐孢子虫感染率差河南农业大学牧医工程学院 2011 届动物医学专业毕业论文2异较大，宁夏、上海、湖南、合肥、河南等地感染率分别为 27、12.1、36.81、50.83、11.40 6。鉴于隐孢子虫病对人类健康和畜牧业生产的巨大危害，自上世纪八十年代以来隐孢子虫病研究日益成为全球范围内人兽共患病领域内的一个研究热点。人们在隐孢子虫分类地位、种类鉴定、分子流行病学、传播机制、免疫机理、检测技术和药物防治等方面进行了大量的探索性研究，取得了丰硕的研究成果 7。目前，
8、隐孢子虫虫定量分析常用方法包括：定量PCR （real-time quantitative PCR，real-time q-PCR)、显微镜计数法（计数显微镜下每个视野中荧光标记或其它化学方法染色虫体） 、酶联免疫吸附分析（ELISA ） 、光化学免疫分析和原位杂交比色法等 8-9。其中 Real-time qPCR不需要对产物进行电泳和密度测定，分析快速，且灵敏度高，重现性好，为目前最常用的定量分析方法。本研究利用实验室已建立的C.baileyi鸡胚培养模型，采用Real-time qPCR方法检测鸡胚尿囊液中C. baileyi，以期建立快速准确检测鸡胚中C. baileyi的方法，为利用
9、C. baileyi鸡胚培养模型进行隐孢子虫药物筛选提供定量方法。1 材料和方法1.1 试验时间、地点本试验研究于 2011 年 2 月至 4 月在河南农业大学牧医工程学院工程楼 0908 寄生虫分子生物学实验室和河南省进出口检验检疫局进行。1.2 试验仪器台式离心机（型号 TDL-403 ） ；OLYMPUS 显微镜 CX21；37C 恒温培养箱；分析天平；1mL 注射器；鸡胚照蛋器；打孔器；血细胞计数器； ABI7500 荧光定量 PCR 仪(美国 ABI 公司) 。1.3 试验材料1.3.1 卵囊及试验动物：1.3.1.1 卵囊：实验室保存的已纯化的鸡源 C. baileyi 卵囊。1.
10、3.1.2 鸡胚：实验室孵化的购自新乡原阳某孵化厂非免疫鸡胚。1.3.2 试验试剂 DNA 提取试剂盒：日本东洋坊公司（ TOYOBO）生产的 Mag ExtractorTM 基因组提取试剂盒；SYBR GreenPCR 试剂盒（TaKaRa 公司生产的 SYBR Primex Ex TaqTM） ；注射用青霉素钠，规格 100 万单位，批号：100904，华北制药集团；注射用硫酸链霉素，规格 100 万单位，批号：100302，华北制药集团；PBS 原液；孔雀绿染色液。 1.3.3 试验试剂的配制孔雀绿染色液：孔雀绿染料 1.6g，十二烷基磺酸钠 10g，在 100 mL 蒸馏水中溶解混匀。
11、使用时将原液稀释 10 倍即为工作液。PBS 原液配制：NaCl:80g， KCl:2.0g ，KH 2PO4:2.0g ，NaH 2PO412H2O:29g，先加入 300mL 双蒸水充分溶解，再定容至 1000mL，配置成 0.1M 的 PBS，使用时将原液稀释 10 倍即为工作液。1.4 试验方法1.4.1 鸡胚接种及尿囊液收取 20 枚 9 日龄鸡胚采用常规鸡胚尿囊腔接种方法，每枚接入 0.2mL 卵囊液，约含卵囊 3.0105 个。7 天后收取全部鸡胚尿囊液-20 保存备用。1.4.2 引物合成根据GenBank发表的C. baileyi（AF093495.1）和原鸡（AF17361
12、2.1）18S rRNA全基因序列，应用Oligo5.0生物学软件设计C. baileyi 18S rRNA基因特异性引物，扩增片段为143 bp。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。序列如下：F5 GTGTGTTTAACACGAGGAAGTTTTAG 3R5 CGATGTATATTCATAAGATTACCCATTT 31.4.3 样品DNA提取及PCR扩增样品 DNA 提取方法参照 Mag ExtractorTM 基因组提取试剂盒说明书进行。引物稀释：按照引物合成单说明将引物用灭菌双蒸水稀释成 25 M 的浓度并置 4 冰箱保存。PCR 反应条件为：94 预变性 5 min；然后 4
13、0 个循环（ 94 ，45 s；62 ，45 s；72 ，1 min)；最后 72 延伸 10 min。河南农业大学牧医工程学院 2011 届动物医学专业毕业论文3在 25 l 体系中加入以下成份：SYBR PreMix(5U/l) 15 lP1 0.5 lP2 0.5 lDNA 1 lddH2O 8 l1.4.4 特异性试验C. baileyi、安氏隐孢子虫、鸡胚尿囊膜细胞、鸡胚气管环细胞、鸡柔内艾美尔球虫和大肠杆菌 DNA模板均由本实验室提供，共同进行 Real-time qPCR。1.4.5 标准曲线的绘制将含 1106 个 C. baileyi 卵囊 DNA 分别稀释成含 1106、1
14、10 5、110 4、110 3、110 2 卵囊 DNA，建立 C. baileyi 18S rRNA 基因 Real-time qPCR 标准曲线。1.4.6 重复性试验将上述含 1106、110 5、110 4、110 3、110 2 卵囊 DNA 分别扩增 3 次，对试验结果进行统计学分析。1.4.7 鸡胚尿囊液中 C. baileyi 18S rRNA 基因扩增采用上述 DNA 提取方法及 Real-time qPCR 反应体系，进行鸡胚尿囊液中 C.baileyi 18S rRNA 基因扩增。2 结果与分析2.1 引物特异性试验结果用 C. baileyi 18S rRNA 基因引
15、物扩增 C. baileyi、安氏隐孢子虫 、鸡胚尿囊膜细胞、鸡胚气管环细胞、鸡柔内艾美尔球虫和大肠杆菌 DNA 模板，仅有 C. baileyi 模板能够扩增出曲线，其它试验所用模板均不能扩增出曲线，说明该引物对 C. baileyi 具有特异性，可以有效准确扩增出鸡胚中 C. baileyi。结果见图1。图 1 特异性曲线A.贝氏隐孢子虫； B.安氏隐孢子虫； C. 鸡胚尿囊膜； D. 鸡胚气管环；E. 鸡柔内艾美尔球虫；F. 大肠杆菌Fig. 1 Curve of specificityA. C. baileyi; B. C. andersoni; C. chorioallantoic
16、membrane; D. chick embryo tracheal ; E. Eimeria tenella ; F. Escherichia coli 河南农业大学牧医工程学院 2011 届动物医学专业毕业论文42.2 标准曲线的绘制由110 6、110 5、110 4、110 3、110 2卵囊DNA绘制的C. baileyi 18S rRNA基因标准曲线线性关系良好，R 2=0.998。 扩增曲线和标准曲线见图2和图3.图2 基于不同拷贝C. baileyi卵囊18S rRNA基因Real-time qPCR扩增曲线Fig. 2 Real-time qPCR log graph bas
17、ed on different DNA copy of 18S rRNA gene of C. baileyi图 3 基于不同 C. baileyi 18S rRNA 基因拷贝 Real-time qPCR 标准曲线Fig.3 Standard curves of Real-time qPCR amplicons for serially diluted DNA copy of 18S rRNA gene of C. baileyi 通过熔解曲线（图 4）可以看出，各扩增产物 Tm 值均为 83.6，没有非特异性产物扩增。AmountCopies1.0 100 1.0E+04 1.0E+06C
18、tCycle 3530252015Slope: -3.524Y-Intercept: 37.59Efficiency: 0.92R2: 0.998河南农业大学牧医工程学院 2011 届动物医学专业毕业论文5图 4 基于不同 C. baileyi 18S rRNA 基因拷贝 Real-time qPCR 溶解曲线Fig.4 Melting curve of Real-time qPCR amplicons for serially diluted DNA copy of 18S rRNA gene ofC. baileyi2.3 重复性试验结果对重复性试验结果进行统计学分析，含 1106、110
19、 5、110 4、110 3、110 2 卵囊 DNA 扩增后阈值（Ct）的平均值标准差分别为 14.250.09、17.460.15、 20.060.18、23.600.11、27.030.07，可见试验重复性较好。2.4 鸡胚尿囊液中 C. baileyi 18S rRNA 基因扩增结果对收集的鸡胚尿囊液进行 Real-time qPCR 扩增结果显示该引物能够扩增出鸡胚尿囊液中 C. baileyi 18S rRNA 基因，从溶解曲线可以看出无非特异性扩增。 3 讨论Real-time qPCR技术具有特异性好，准确性和灵敏度高，操作简单，自动化程度高，交叉污染和污染环境机会少等优点，其
20、用途主要集中于3 个方面。第一，定性分析：用于病毒、病原菌检测及生物品种间鉴定；第二，绝对定量：用于病毒或病原菌的定量分析。第三，相对定量：用于mRNA表达量分析和siRNA效果确认等。目前，Real-time qPCR技术在隐孢子虫检测及药物筛选方面应用较广。Higgins等 10研究两种商用试剂盒是否适用于从粪样中提取DNA用于荧光定量PCR，认为商用DNA提取试剂盒可以用于荧光定量PCR ，最适宜于抑制因子少的样品，若样品中含有大量抑制因子则建议用巢氏PCR做进一步验证。Keegan 11等建立Taqman PCR技术检测细胞培养中微小隐孢子虫（C. parvum）的方法，并利用该方法检
21、验几种常用的自来水消毒剂对隐孢子虫的影响，研究认为混合氧化剂及氯气对隐孢子虫的杀灭作用极其有限。King等 12采用Taqman PCR技术检测细胞培养中隐孢子虫的方法，检验在不同温度保存的卵囊感染力的变化，研究认为温度越高隐孢子虫代谢越快，可以据此判断隐孢子虫的感染风险。Cai等 13采用反转录Taqman PCR技术检测细胞培养中C. parvum的方法，检验巴龙霉素和硝唑尼特对C. parvum在HCT-8细胞培养中的抑制作用 。Di等 14采用Taqman PCR 技术对隐孢子虫的细胞培养方法进行了优化。目前，经改进的荧光定量方法已应用于食物水源中隐孢子虫的检测及隐孢子虫药物筛选等研究
22、 15-16。国内对隐孢子虫荧光定量检测方法研究刚刚起步，仅2009年李安平等 17基于Taq-Man探针建立了安氏隐孢子虫Real-time qPCR检测方法，质粒DNA 和卵囊的检测阈值分别达到 5个拷贝和10个卵囊。继而李安平等18建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time qPCR方法，建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感，可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查。本试验采用 C. baileyi 18S rRNA 基因引物扩增 C. baileyi、安氏隐孢子虫、鸡胚尿囊膜细胞、鸡胚气管环细胞、鸡柔内艾美尔球虫和大肠杆菌 DNA 模板，仅有 C. b
23、aileyi 能够扩增出曲线，其它试验所用模板均不能扩增出曲线，说明该引物对 C. baileyi 具有特异性。由 1106、110 5、110 4、110 3、110 2 卵囊DNA 绘制的 C. baileyi 18S rRNA 基因标准曲线线性关系良好，R 2=0.998，扩增曲线呈现出良好的 S 型。对 1106、110 5、110 4、110 3、110 2 卵囊 DNA 重复性试验扩增，阈值（Ct）平均值标准差分别为14.250.09、17.460.15、20.060.18、23.600.11、27.030.07，试验结果重复性良好。综上，本试验建立 SYBR Green real
24、-time qPCR 检测鸡胚中 C.beileyi 方法，引物特异性强，系标准曲线线性关良好，没有引物二聚体及非特异性扩增产物出现，可用于对 C.baileyi 在鸡胚中繁殖规律分析和药物筛选评估。河南农业大学牧医工程学院 2011 届动物医学专业毕业论文6致谢：本试验研究 是在菅复春老师的悉心指导和亲切关怀下，在河南农业大学牧医工程学院寄生虫实验室进行的，张云师姐、黄磊师兄给与了各方面的指导与支持，在此表示由衷的感谢！参考文献：1 ODonoghue PJ. Cryptosporidium and cryptosporidiosis in man and animalsJ. Interna
25、tional Journal for Parasitology, 1995, 25(2):139195.2 Fayer R, Morgan U, Upton SJ. Epidemiology of Cryptosporidium transmission, detection and identificationJ. International Journal for Parasitology, 2000, 30(12-13): 1305-1322.3 Dirk C, de Graaf DC, Vanopdenbosch E, et al. A review of the importance
26、 of Cryptosporidiosis in farm animalsJ. International Journal for Parasitology, 1999,29(10):12691287.4 张龙现,蒋金书. 隐孢子虫和隐孢子虫病研究进展J.寄生虫与医学昆虫学报,2001 ,8 (3):184 -191.5 孙铭飞,张龙现,宁长申,等.禽类隐孢子虫研究进展J.中国人兽共患病杂志,2005,21(6):522-525.6 孙彦平,张龙现,菅复春,等.河南省规模化鸡场隐孢子虫感染情况调查 J.中国家禽,2008,30(4):49-52.7 Michael J. Arrowood. 2
27、002 In Vitro Cultivation of Cryptosporidium SpeciesJ. Clinical Microbiology Reviews, 15(3):390-400.8 Di Giovanni, M W LeChevallier. Quantitative-PCR assessment of Cryptosporidium parvum cell culture infectionJ. Applied Environment Microbiology,2005,71(3):1495-1500.9 MacDonald L M, K Sargent, A Armso
28、n,et al. The development of a real-time quantitative-PCR method for characterization of a Cryptosporidium parvum in vitro culturing system and assessment of drug efficacyJ. Molecular Biochemical Parasitology, 2002, 121(2):279-282.10 Higgins J A, R Fayer, J M Trout,et al. Real-time PCR for the detect
29、ion of Cryptosporidium parvumJ.Microbiology Methods, 2001,47(3):323-337.11 Keegan A R, S Fanok, P T Monis,et al. Cell culture-Taqman PCR assay for evaluation of Cryptosporidium parvum disinfectionJ. Applied Environment Microbiology, 2003, 69(5): 2505- 2511.12 King B J, A R Keegan, P T Monis, et al.
30、Environmental temperature controls Cryptosporidium oocyst metabolic rate and associated retention of infectivityJ. Applied Environment Microbiology, 2005, 71(7): 3848-3857. 13 Cai X, K M Woods, S J Upton, et al. Application of quantitative real-time reverse transcription-PCR in assessing drug effica
31、cy against the intracellular pathogen Cryptosporidium partum in vitroJ. Antimicrobiology Agents Chemother, 2005, 49(11): 4437-4442.14 Di Giovanni G D, M W Le Chevallier. Quantitative-PCR assessment of Cryptosporidium parvum cell culture infectionJ. Applied Environment Microbiology, 2005,71 (3):1495-
32、1500.15 Garcs-Sanchez G, Wilderer PA, Munch JC, et al. Evaluation of two methods for quantification of hsp70 mRNA from the waterborne pathogen Cryptosporidium parvum by reverse transcription real-time PCR in environmental samplesJ.Water Research, 2009, 43(10):2669-2678. 16 Minarovicov J, Kaclkov E,
33、Krascsenicsov K,et al.A single-tube nested real-time polymerase chain reaction for sensitive contained detection of Cryptosporidium parvumJ. Letter in Applied Microbiology, 2009, 49(5):568-572. 17 李安平, 王 权, 黄克和, 等. Real-time qPCR 检测安氏隐孢子虫卵囊方法的建立及应用J. 中国兽医学报,2009,29 (5): 619-622.18 李安平, 黄克和 , 王权. 微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫 SYBR Green real time PCR检测方法的建立J. 中国兽医科学,2009,39(6):510-515.
