1、毕业论文(设计)题 目 浅谈酸性蛋白酶姓 名 吴茜 学号 014008210289专 业 生物工程（070404）指导教师 鞠守勇 职称 讲师中国武汉二一二年三月华中农业大学学士学位论文（设计）- 1 -目 录摘要3关键词3Abstract3Key words3前言31.蛋白酶的发展历程41.1 蛋白酶的定义41.2 微生物蛋白酶的分类41.3 蛋白类酶42.酶的生产方法43.酸性蛋白酶制剂的性能43.1 酸性蛋白酶的作用机理43.2 PH 对酶活及酶稳定性的影响53.3 温度对酶活性及稳定性的影响53.4 金属离子对酶活力的影响53.5 酸性蛋白酶制剂酶活力定义54.酸性蛋白酶制剂的生产54
2、.1 工业级酸性蛋白酶制剂的生产54.2 食品级酸性蛋白酶制剂的生产54.3 生产菌株的选择54.4 发酵培养基64.5 发酵条件控制64.6 酸性蛋白酶提取工艺74.7 提高酸性蛋白酶产量的措施85.酸性蛋白酶的应用及发展8参考文献8致谢9华中农业大学学士学位论文（设计）- 2 -浅谈酸性蛋白酶摘 要酸性蛋白酶在食品、医药、纺织、皮革、饲料、化妆品、洗涤行业都有应用，天然卫生、无毒无害、十分安全。所以本文多酸性蛋白酶的基本内容、生产工艺及应用发展做了简要的介绍。关键词蛋白酶；生产工艺；发展及应用Acid prolealytic enzymeAbstractAcid protease in f
3、ood, medicine, textile, leather, feed, cosmetics, washing industries have applications, natural health, avirulent and harmless, quite safe. So in this paper the basic content of more acid protease, production process and application development were introduced.Key wordsprotease; Production process;
4、Development and application 前言水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的月示和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适 pH 值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适 pH 值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱华中农业大学学士学位论文（设计）- 3 -性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。 微生物酸性蛋白酶国外从 60年代就开始研制，而我国 1
5、970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株 3350 产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。由于 3350 酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂，1977 年被中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的 537高产酸性蛋白酶菌种取代。目前国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用 537酸性蛋白酶菌种生产，发酵酶活力一般在 60007000uml，成品剂型有工业级的粉剂、食品级的粉剂和浓缩剂，成品的酶活力有 5万 ug、4 万 ug、2 万 ug（ml） 。1 蛋白酶的发展历程1.1 蛋白酶的定义蛋白酶
6、是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。1.2 微生物蛋白酶的分类微生物蛋白酶按其作用的最适 pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度 5060，最适 pH8.5。中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度 4555，最适pH5.57.5。酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度 45，最适pH2.5。1.3 蛋白类酶蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P 酶） ；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R 酶）
7、 。蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶） 。2 酶的生产方法酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。3 酸性蛋白酶制剂的性能华中农业大学学士学位论文（设计）- 4 -3.1 酸性蛋白酶的作用机理酶是一
8、种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2540）水解动植物蛋白质，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。3.2 pH 对酶活及酶稳定性的影响酸性蛋白酶稳定 pH范围 2.04.0 之间，最适 pH2.5，pH 低于 20、高于 40 将影响水解速度。3.3 温度对酶活性及稳定性影响酸性蛋白酶适宜温度范围 3050，最适作用温度为 50，低于 40酶活稳定，超过 50，酶活性损失严重。3.4 金属离子对酶活力的影响酸性蛋白酶可被 Mn2、Ca2、Mg2离子激活，被 Cu2、Hg2、Al3
9、离子抑制，液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中失活较多。3.5 酸性蛋白酶制剂酶活力定义酸性蛋白酶活力是指 1克固体酶粉或 1ml液体酶，在 45左右和 pH2.5条件下，1 分钟水解酪酸蛋白产生 1微克酪氨酸即为一个酶活力单位。酸性蛋白酶 45酶活为 50138左右。4 酸性蛋白酶制剂的生产4.1工业级酸性蛋白酶制剂的生产开始生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析，板框压滤，气流（沸腾）干燥，粉碎，化验，包装制成工业级粉剂酸性蛋白酶。4.2食品级酸性蛋白酶制剂的生产随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品
10、级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶前发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤饼经干燥后可做饲料酶添加剂，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂（见附表） 。因浓缩剂酸性蛋白酶要求在低温存放，环境温度超过 15严重失活，只能短时间就近使用，但浓缩酶经载体（食用级淀粉）吸附干燥后，在常温下可长时间存放不失活。食品级酸性蛋白酶与工业级酸性蛋白酶检测酶活力都是按照 qb1805393 执行，但食品级酸性蛋白酶，不含有对人体有害的物质，是采用食品级淀粉作为载体，吸附干燥制成粉剂。为满足粮食生产酒精、白酒、啤
11、酒工艺的需要，微生物指标有着严格要求，除致病菌不得检出外，每克粉剂或每毫升浓缩剂酸性蛋白酶、杂菌酶，不得高于 5000个g（ml） 。 4.3生产菌株的选择目前已经用于生产酸性蛋白酶的微生物菌株有：黑曲霉、米曲霉、拟青霉、啤酒酵母、华中农业大学学士学位论文（设计）- 5 -乳酸杆菌、枯草杆菌等，其中以黑曲霉为主，这些曲霉产生的蛋白酶有一定的耐酸性和耐热性。我国生产酸性蛋白酶的菌株有黑曲霉 AS 3.301，AS 3.350 等。黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌，菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。黑曲霉可以用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶，主
12、要用于酸性蛋白酶等的生产。4.4发酵培养基 产酸性蛋白酶的微生物，它们的发酵培养基都基本选择麸皮、米糠、玉米粉、淀粉、饲料鱼粉、豆饼粉、玉米浆等各种碳氮源，按各种不同比例混合，添加无机盐配成各种培养基。C源：蛋白酶的生产既受分解代谢产物阻遏也受底物的诱导。葡萄糖等容易利用的碳源常可引起分解代谢阻遏使产酶降低，因此通常用大麦粉、玉米粉、淀粉，有时也用麦芽糖做碳源。黑曲霉生产酸性蛋白酶时利用玉米粉作为碳源。N源：黑曲霉生产酸性蛋白酶时需要较高浓度的氮源浓度，在有机氮存在时，NH4+或NO3-对黑曲霉生产酸性蛋白酶有显著促进作用。故一般采取高浓度的有机氮并辅与浓度为1%-3%的无机氮。有机氮常用蛋白
13、胨、豆饼粉、鱼粉的石灰水解物等。无机盐：磷酸盐对微生物蛋白酶的生产很重要。磷酸盐对微生物蛋白酶的生产很重要，使用麸皮、米糠等含磷较丰富的原料时，添加磷酸盐对产酶具有促进作用，在黑曲霉3.350酸性蛋白酶的生产培养基中添加 0.1%0.3%的磷酸盐可使酶活性提高 20%30%。Ca2+对某些菌株产蛋白酶具有很大影响，培养基中添加 0.5%CaCl2黑曲霉 3.350酸性蛋白酶的产量会提高 40%左右。其他成分：向培养基中添加适量表面活性剂可以改善细胞膜的通透性或诱导酶的生成，在一定条件下可显著促进蛋白酶的生产。下面列出的是黑曲霉 3350 发酵培养基的配方：玉米粉 6 豆饼粉 4 玉米浆 0.6
14、 氯化铵 1.0 氯化钙 0.5 磷酸二氢钠 0.2豆饼石灰水解液 104.5 发酵条件控制（1）接种量：适当控制接种量对菌株产酸性蛋白酶的活力关系很大。一般接种量为 5%10%，华中农业大学学士学位论文（设计）- 6 -且有研究表明 5的接种量比 10的接种量要好。（2）pH：pH 对于生产酸性蛋白酶的菌株来说，培养基的起始 pH对其产量有较大的影响，黑曲霉酸性蛋白酶的最适 pH是 2.52.7，但黑曲霉 AS 3.350发酵产生酸性蛋白酶培养基的最初浓度应调节为 4.55.5左右。（3）温度：黑曲霉酸性蛋白酶生产对于温度的变化很敏感，黑曲霉正常发酵控制在 30左右。 （4）通风量： 液体深
15、层培养中大部分微生物在合成蛋白酶时需要强烈搅拌通风。氧是黑曲霉生物合成酸性蛋白酶必须的，通风量较大对产酸性蛋白酶有利，通风气量不足对黑曲霉菌丝体的生长无明显影响，但对酶产量有严重的影响，通风量对产酶的影响在培养前期更为明显，短暂停止通风搅拌会导致酶产量急剧下降。因此发酵工程中应控制好通风量，024h为 1:0.25,2448h为 1:0.5,48h至结束为 1:1.0，发酵周期为 72h左右。（5）氧载体：在发酵过程中，在发酵培养基中加入正十二烷、全氟化碳，液态烷烃(为1216碳直链烷烃混合物)等氧载体，使培养基中氧传递速度加快，产生气泡少，剪切力小，能明显提高菌株产酸性蛋白酶的量。（6）灭菌
16、：工业发酵稳产的关键条件之一是在整个生产过程中维持纯种培养，避免杂菌的入侵。行业上把过程污染杂菌的现象简称染菌。染菌对工业发酵的危害，轻则影响产品的值和量，重则倒灌，颗粒无收，严重影响工厂的效益。应该注意对培养基、发酵罐、通入空气等进行灭菌，包含空消和实消等过程。（7）消泡：泡沫堆积多降低了发酵罐的装料系数；增加了菌群的非均一性；增加了污染杂菌的机会；大量起泡会引起逃液，招致产物流失；消泡剂的加入有时会给发酵或提炼加工带来不便。因此，应该尽量避免泡沫的产生。4.6 酸性蛋白酶提取工艺酸性蛋白酶生产的最后一道工艺就是提取，提取的方法主要有盐析沉淀法、单宁酸沉淀法，或者采取多种方法结合来提取酸性蛋
17、白酶。4.6.1 盐析沉淀法 将培养物滤去菌体用盐酸调节 pH4.0以下，加入硫酸铵至浓度 55%，静置过滤弃上清液，将沉淀压滤去母液，于 40烘干磨粉，得到工业用的粗制酶制剂粉末。亦可将发酵液滤除菌体后，使用刮板式薄膜蒸发器 40浓缩 34倍，可直接作为液体的粗酶制剂商品。医药和啤酒工业用酶需盐析后进一步用离子交换树脂脱色处理，然后浓缩并以阳离子树脂华中农业大学学士学位论文（设计）- 7 -脱盐，最后干燥、磨粉，得到淡黄色或乳白色粉末。4.6.2 单宁酸沉淀法单宁酸是一种离子型表面活性剂，能与蛋白质形成复合物而使其沉淀，将发酵液过滤后调节 pH5.5左右，在搅拌下向滤液中加入 10%单宁酸，
18、使单宁酸的终浓度为 1%左右，静置 1h，离心收集酶与单宁酸的复合物。接着向此复合物中加入 10%聚乙二醇（相对分子质量 6000）溶液，使聚乙二醇用量为原酶液的 0.3%0.5%。然后不断搅拌，离心去除单宁酸聚乙二醇聚合物（浓缩量 10倍，收率 90%以上） ，再将浓缩酶液调节 pH4.5左右，加入糖用活性炭 3%脱色，得到浅黄脱色酶液（回收率 90%95%） 。脱色液在低温下以乙醇沉淀活用硫酸铵盐析，干燥后制得浅色酶粉，其活性可达 4X105U以上，总收率 70%以上。4.7 提高酸性蛋白酶产量的措施（1）添加诱导物包括酶的作用底物、反应产物、作用底物的类似物等。（2）控制阻遏物的浓度，解
19、除反馈阻遏、分解代谢物阻遏等，主要通过减少葡萄糖等易分解利用的碳源而用玉米粉、大麦粉等做碳源。（3）添加表面活性剂包含离子型 、非离子型的表面活性剂等。5 酸性蛋白酶的应用及发展酸性蛋白酶的用途可以说是涉及到生活中的方方面面：医学、农业、日常生活、皮革制造等。使用酸性蛋白酶的软化浴（含酸性蛋白酶 1020U/ml、食盐 3%、芒硝（Na2SO410H2O）6%，pH2.53.0）在裘皮生产中可使出皮率提高 5%10%，皮板抗强度增加 30%，收缩温度提高 30，质量减轻 5%10%；在羊毛处理中使处理时间由 100min减少到 30min，毛纱断头率下降 50%，使花毛毯拉力强度增加 67%；
20、在医药中酸性蛋白酶是良好的消炎剂，可用它来化痰止咳、消炎退肿、清洁创面、帮助脱痂等。因此大力开展酸性蛋白酶的研究与生产，不断提高其产量及质量，具有很好的市场及发展前景。参考文献华中农业大学学士学位论文（设计）- 8 -1酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江2中国酸性蛋白酶行业动态监测与投资前景预测报告（专家版）2012-2016 年.致谢本论文是在我的指导老师鞠守勇的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到论文的最终完成，鞠老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持，在此谨向鞠老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！感谢武汉职业技术学院生物工程系的全体老师在几年的大学生活和学习中给予的关心和帮助，同时衷心感谢应用化学实验室，生化分离实验室，微生物实验室的实验员老师在我大学期间给予的帮助，才使我的课业能顺利进行。感谢武职微生物 10301班所有的同学和代课老师，他们让我的大学生活丰富多彩。最后，我要特别感谢我的家人，没有你们的支持，就没有今天的我。 愿把我的幸福和快乐都送给关心和支持过我的人，也愿他们一切如意！
