1、12 0 1 1 届本科毕业生毕业论文题目：732-型阳离子交换树脂提取溶菌酶方法初探作者姓名： 何鹏 李龙凤 刘刚 指导教师： 刘秀丽（讲师） 学科专业： 生物技术 院 系: 生命科学与技术学院 提交日期： 2011-06-02 2732-型阳离子交换树脂提取溶菌酶方法初探何鹏 李龙凤 刘刚指导老师：刘秀丽 讲师（陇东学院生命科学与技术学院 07 生物技术班 甘肃 庆阳 745000）摘要 该实验首先通过等电点沉淀法原理，调 PH4.6 使蛋清中杂蛋白沉淀下来，离心过滤对溶菌酶进行初步分离。提纯后的样品通过绘制标准曲线测定其蛋白浓度，随着纯化的进行，样品中溶菌酶含量不断增加。利用分光光度仪测
2、定吸光值并绘制曲线，根据酶活定义，通过计算发现利用 732 型阳离子交换树脂提纯倍数可达到 590，酶活保留原酶活的 41%。再经 SDS-PAGE 电泳分析表明离子交换层析纯化后的样品纯度较高，且条带清晰，能够达到预期的目的。关键词 蛋清 溶菌酶 阳离子交换层析 电泳Study on the Extraction of Lysozyme by 732 - type of the cationic exchange of the resin in Egg-whiteLilongfeng1 Hepeng1 Liugang1 Liuxiuli2(Electrial Engineering Coll
3、ege ,Longdong University,Qingyang 745000,Gansu,China)Abstract The experiments adopt wait a bit of the sedimentaryis of principle, be transferred to a PH4.6, the filter is desire for the eggs out truffles are an enzyme in the preliminary from impurities. The standard through the drawn to determine th
4、e whites, the concentration of purification, as the samples are virus concentration kept increasing, the use of a spectrophotometer apparatus to measure a light, to draw curves based on a definition of work, 732 type of the cationic exchange resin purified multiple 590 enzymes can be achieved, the e
5、nzymes to keep alive the enzyme 41%. To the sds - page electrophoresis analysis indicates the purity of the purification, higher, and capable of achieving the intended purpose. Key Words Eggs clear Are bacteria enzymes The cations present exchange floor and Electrophoresis31引言在环境污染日趋严重，大力倡导绿色食品的今天，溶
6、菌酶作为一种天然蛋白，能在胃肠道内作为营养物质被消化吸收，且对人体无害是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品、药品，因为它可以水解细菌细胞壁的 -1，4 糖苷键，从而破坏肽聚糖支架而得名1。溶菌酶作为一种碱性球蛋白，其化学性质非常稳定，PH 在 1.2-11.3 范围内剧烈变化时，其结构几乎无改变。耐热性极高，100 OC 处理 1min 任然保持原酶活性。溶菌酶对变性剂相对不敏感，但吡啶、十二烷基磺酸钠对酶有抑制作用，氧化剂能使酶钝化。溶菌酶在医药上用途非常广泛，它可与血液中的病毒结合防治流感有利于脓汁痰液的排出，能清除坏死组织，增强抗生素的药效，临床上还应用于五官科多种粘膜疾病。此外，日
7、本还用固定化溶菌酶技术处理废水取得了很好效果 2。正因为溶菌酶日益具新的功能，人们对它的研究也经久不衰。关于溶菌酶的分离和纯化方法主要有结晶法,离子交换法,和色谱法等。亲和色谱法分离溶菌酶也是一种有效手段 3，由于其分离具有较高的选择性，可以从蛋清中分离溶菌酶，但由于亲和柱造价高，制作困难等缺点使其应用受到限制。离子交换法是制备高纯度溶菌酶最常用的方法 4。由于该方法无需加热，溶菌酶不易变性失活，制备得到活性较高的溶菌酶。此外，离子交换法还具有简便，高效，成本低，可以自动化连续操作等优点，提纯后的蛋清不受破坏 5。离子交换法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间的离子交换而进行的，由于
8、溶菌酶是一种碱性蛋白质，故可采用阳离子交换树脂。目前国内外可采用的离子交换树脂主要有 724-型阳离子交换树脂，大孔离子交换树脂，CM-纤维素等 6。本实验主要是利用 732-型阳离子交换树脂对蛋清中的溶菌酶进行分离纯化。2 实验部分2.1 主要仪器及药品主要仪器：电热恒温水浴锅（HHS11-2B） 离心机(LXG-64-01) 电子天平 核酸蛋白检测仪（HD-2001-B-C） 自动部分收集器（BSZ-160） 电脑恒流泵（DHL-A） 层析谱采集分析仪（HD-A）Sartoius 离心机 电泳仪（DYY-2C）电泳槽（Bio-rad-protean 美国伯乐公司）恒温振荡器（SHA-B）7
9、22-分光光度计 直冷式冷冻冷藏冰箱 移液管（10mL） 、移液枪。主要试剂：鸡蛋清 732-阳离子交换树脂 PBS( pH8.0) 考马斯亮蓝 小牛纯血清蛋白、枯草芽孢杆菌液、丙烯酰胺、bis、AP、SDS、Tris。2.2 实验方法42.2.1 溶菌酶的粗提取（等电点沉淀法） 拿四个鸡蛋破壳取蛋清置于烧杯中，记录其体积 V1（140ml）加入 pH7.5 PBS 缓冲液搅拌均匀留样（样品 S1）, 用冰醋酸调 pH4.7 左右,3500rpm，离心 20min 取上清,再用 pH8.0 PBS 缓冲液，搅拌均匀,5mol/L NaOH 调 pH8.0 滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V2（
10、400ml） ，留样 S2。2.2.2 溶菌酶的分离纯化(离子交换层析法)将上一阶段烧杯中的 S-2 样品分成三份进行下列操作装柱:取 20mL732 型阳离子交换树脂，1.0*20cm 层析柱，以 0.02M PBS,pH8.0 为缓冲液装柱平衡:用泵将 3 倍柱床体积的 0.02M PBS pH8.0 过柱上样:用泵将 S2 样品泵入层析柱，经过一段时间之后，蛋白将通过离子交换的方式，与介质相互作用而挂柱。注意观察并记录 280nm 下吸收值的变化冲平:用 0.02mol/L pH8.0 的 PBS 洗涤离子交换柱至无穿透峰为止 7。在吸收峰下降段留样 S3（s3*水平段留样） 洗脱:将分
11、开的三个样分别用不同浓度的 PBS 进行梯度洗脱（收集洗脱峰，留样 S4,S4*）。得到离子交换层析层析图谱如下:1号 样 层 析 图 谱00.020.040.060.080.10.120 20 40 60 80 100 120Time(min)Absorb2号 样 层 析 图 谱00.020.040.060.080.10.120 20 40 60 80 100 120T（ min）Absorb3号 样 层 析 图 谱00.020.040.060.080.10.120 20 40 60 80 100 120Time(min)Absorb图 1 样品离子交换图谱见图 1：结果表明在三个样品离子交
12、换层析过程中，冲平峰和洗脱峰明显。2.2.3 蛋白质标准曲线的制作及样品蛋白含量与酶活的测定5以 A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标在坐标轴上绘制标准曲线。如下图： y = 3.1443x + 0.0163R2 = 0.998500.050.10.150.20.250.30.350 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12溶 菌 酶 浓 度 mg/ml吸光度图 2 蛋白质标准曲线见图 2,标准曲线回归方程 Y=3.1443X+0.0163,R2=0.9985,根据所测定的 A595nm，利用标准曲线或回归方程求出相当于标准蛋白质的量（g） ，从而计算出未知样品的蛋白质浓
13、度（ug/mL） 。 表 1 测定后样品蛋白信息样品 吸光值 稀释倍数 总体积(ML) 蛋白浓度(ug/ml)S1 0.097 0.107 1000 140 32S2 0.107 0.084 500 400 181S3 0.119 0.109 10 15 0.321S4 0.207 0.209 0 22.5 0.0612S3 0.179 0.186 10 18 0.572S4 0.222 0.200 0 20 0.0612S3* 0.161 0.170 10 5 042S4* 0.265 0.249 0 5.7 0.0713S3 0.124 0.130 10 19.5 0.353S4 0.10
14、4 0.100 0 21 0.03见表 1：表明随着纯化步骤地进行，样品中蛋白质的总量逐渐降低，溶菌酶在总蛋白中的含量提高。2.3.4 溶菌酶的活性测定取枯草芽孢杆菌的过夜培养物，3500rpm 常温离心 5 分钟，弃上清，沉淀用 PBS 缓冲液悬浮，利用可见光分光光度计测其 OD595并记录。30s 测定一次吸光度值，约 3min 内至吸光度达到稳定。在室温，以 1 号管为对照，每隔 30s 分别测定样品在 595nm 的吸光度。 观察悬液 OD595反应前后的变化。根据酶活定义，测定溶菌酶 S1S4 活性。活力单位（U）：6酶在室温（25） ，pH8.0 条件下，OD 595每分钟降低 0
15、.001 为 1 个活力单位 U。结果分析如下： s1 y = -0.0324x + 1.168700.20.40.60.811.20 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）ODs2 y = -0.0245x + 1.21230.9511.051.11.151.21.250 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）OD1S4 y = -0.0046x + 1.15941.111.121.131.141.151.160 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）OD2S3 y = -0.0044x + 1.16411.111.121.131.141.15
16、1.161.170 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）OD2S3* y = -0.0045x + 1.11461.061.071.081.091.11.111.120 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）OD1S3 y = -0.005x + 1.21611.161.171.181.191.21.211.220 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 (min)OD72S4* y = -0.0027x + 1.07591.0451.051.0551.061.0651.071.0750 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）OD2S4 y
17、= -0.0049x + 1.04610.9911.011.021.031.041.050 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min)OD3S3 y = -0.0039x + 1.06771.0251.031.0351.041.0451.051.0551.061.0651.070 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）OD3S4 y = -0.0034x + 1.05461.0151.021.0251.031.0351.041.0451.051.0550 0.5 1 1.5 2 2.5 3时 间 （ min）OD图 3 酶活曲线表 2 样品蛋白酶活样品 曲线斜率 标
18、准单位 活力单位 稀释倍数 总酶活（U）S1 0.0324 0.001 32.4 1400 45360S2 0.0100 0.001 10 4000 400001S3 0.0029 0.001 2.9 1000 29001S4 0.0046 0.001 4.6 3000 138002S3 0.001 0.001 1 2100 21002S4 0.0049 0.001 4.9 3750 183752S3* 0.0023 0.001 2.3 500 11502S4* 0.0027 0.001 2.7 570 15393S3 0.002 0.001 2 1800 36003S4 0.0034 0.0
19、01 3.4 2250 76508表 2:结果表明比较各样品纯化前后比活力的大小,发现等电点沉淀法粗提溶菌酶的提纯倍数约为 1.34 ,而离子交换柱层析法的提纯倍数约为 590.16。前者的酶活性回收率约为95%，后者约为 41%。2.2.4 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（SDS-PADE）蛋白样品的处理:取上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入 2上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口，在 100沸水浴中加热 35min，取出后10000r/min 离心 10min，取上清待用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳: 基本步骤是装板，封底，配胶，装胶，凝固，点样，电泳，染色，脱色，甘油保存，凝
20、胶扫描求出溶菌酶的相对分子质量。凝胶成像系统处理记录 9 图 4 样品电泳图谱表 3 样品电泳图谱分析数据Number Mol. weight Height Raw vol.Track 1 M1(m) 20000.00 8.385 10766.212(m) 14400.00 8.836 7356.55Track 2 3S41(m) 20195.11 12.271 4091.522(m) 14737.37 21.775 132635.30Track 3 S21(m) 19609.30 30.296 307568.282(m) 14624.05 43.573 295251.69Track 4 S1
21、91(m) 32406.77 10.782 11233.202(m) 19358.65 46.477 715355.633(m) 14070.36 50.431 1163351.884(m) 8002.03 16.756 129861.69Track 5 1S41(m) 33042.16 11.648 4955.392 19408.52 46.013 820163.63Track 6 2S3*1 32677.58 9.242 77104.372 19659.83 19.390 457729.75Track 7 2S4*1 19795.19 18.592 398029.562 14712.11
22、32.092 359515.59Track8 2S41 19744.32 17.930 67483.982 14953.84 30.912 381216.13Track 9 3S3*1(m) 19693.58 12.671 82021.33Track 10 1S31(m) 19948.60 14.131 127141.162(m) 15005.22 12.730 104883.86Track 11 2S31 31520.24 10.859 162298.162(m) 20111.25 19.879 36108.95见表 3：结果表明样品 S1，S2 中蛋白种类较多，且浓度较高，可见光吸收峰的面
23、积也较大。离子交换层析后收集的样品所含蛋白种类少，且所有洗脱样品中都有相似的条带，与标准样对比可知其分子量在 14400-15134 之间，证明此条带为溶菌酶。3 讨论目前国内从蛋清中分离纯化溶菌酶，使用 724-型阳离子交换树脂提纯倍数能达到 26510倍，酶活保留原酶活的 70%，而采用 CM-纤维素的提纯倍数可达到 490 倍 8。但该实验通过使用 732-型阳离子交换树脂层析法对蛋清中的溶菌酶进行分离提纯，达到了约 590 倍的纯化效果，由于其较好的提纯效果，为今后采用 732-型阳离子交换树脂层析法分离提纯蛋清中的溶菌酶提供了一定的参考性。但酶活性仅保留了原总酶活的 41%,说明总酶
24、活损失较多。主要原因是酶过长时间保存在冰箱中,温度长期处于低温状态,加之层析柱规格较小，树脂使用量不够，很大程度的影响了酶活。今后实验在这几方面加以注意，相信会达到更好的效果。参考文献1方元超,梅丛笑,尹宁. 溶菌酶及其应用前景J中国食品添加剂, 1999, (04) . 2戴清源,陈祥贵,李晓霞,张庆. 溶菌酶的研究进展J山东食品发酵, 2005, (03) .3史小利,李宗谦,徐淑霞.蛋清溶菌酶提取工艺研究J现代农业科技，2008, (06) . 4陈慧英,吴晓英. 溶菌酶分离纯化方法的研究新进展J广东药学院学报 2003, (04) . 5俞卫华,钱俊青. 732 树脂吸附蛋白质的机理研
25、究J氨基酸和生物资源, 2002, (02) . 6ZHANG Xin-bao,chen hong-bing,gao Jin-yan.Comparison of two different ion chromatography methods in purification of egg white lysozymeJ Science and Technology of Food Industry,2010,(11).7余海芬,马美湖,刘岩. 阳离子交换法提取蛋清溶菌酶的研究J中国家禽, 2008, (24) . 8赵玉萍,张灏,杨严俊. 溶菌酶测定方法的改进J食品科技, 2002, (01) .9魏义长,张慧琴,谢慧玲,赵成壁.凝胶成像分析系统J分析测试技术与仪器,2001 (03) .
