1、河北农业大学本科毕业论文1本 科 毕 业 论 文蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定专业名称：生 物 科 学 1302学生姓名： 贾 旭 学 号： 2013044020206 导 师： 韩 军 河北农业大学本科毕业论文1蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定摘 要分离和纯化培养法在实验中常常是分离杂菌筛选所需菌落的有效方法，紫外线诱变可以试验出菌落突变率最高的诱变时间或诱变强度，从而选择最适剂量对纯化菌株进行诱变，产生性能更加优秀的可育后代，这就是菌株的选育过程。本实验采用以上方法对土壤中的杂菌进行分离纯化，得到纯化的能分解蛋白质的菌株，通过紫外线诱变而获得分解能力强的菌株，即高产蛋白酶的菌株。菌种鉴定
2、则是对微生物快速深入了解的捷径。关 键 字灭菌、培养基、无菌操作、分离纯化、紫外线诱变、菌种鉴定Abstract英文省略。正 文1.蛋白酶菌种的采样由于采样的菌种需要有分解蛋白质的能力，所以采样地点可以是餐饮聚集地或者种植大豆等富含高蛋白植物的土地。2.蛋白酶菌种的分离纯化2.1.实验用品的灭菌灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类.本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌. 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种.通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的.蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低.在同一温度下,湿热的杀菌效力
3、比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力.本实验采用高压蒸汽灭菌法。河北农业大学本科毕业论文12.1.1.灭菌前的准备 玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并
4、拧几下,再将包好的吸管集中灭菌. 2.1.2.高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法.这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的.当蒸汽压力达到 1.05kg/cm2 时,水蒸气的温度升高到 121,经 1530min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢.一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。2.1.3 火焰灭菌 直接用火焰灼烧灭菌,迅速彻底.对于接种环,接种针或其它金属用具,可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌.此外,在接种过程中,试管或三角瓶口,也采用通过火焰而达到灭菌的目的.2.1.3.操作
5、方法和注意事项 加水：打开灭菌锅盖,向锅内加水到水位线.立式消毒锅最好用已煮开过的水,以便减少水垢在锅内的积存.注意水要加够,防止灭菌过程中干锅. 装料、加盖：灭菌材料放好后,关闭灭菌器盖,采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋,使蒸汽锅密闭,勿使漏气. 排气：打开排气口(也叫放气阀).用电炉加热,待水煮沸后,水蒸气和空气一起从排气孔排出,当有大量蒸汽排出时,维持 5min,使锅内冷空气完全排净. 升压、保压和降压：当锅内冷空气排净时,即可关闭排气阀,压力开始上升.当压力上升至所需压力时,控制电压以维持恒温,并开始计算灭菌时间,待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在 121,20min）后,停止加
6、热,待压力降至接近“0”时,打开放气阀.注意不能过早过急地排气,否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外. 灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于 37培养箱中培养,经 24h 培养无菌生长,可保存备用；斜面培养基取出后,立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后,空白培养.2.2 菌液的配置准备 10 支试管，第一支加入 10mL 蒸馏水，其余加入 9mL 并编号 110。将采样的土河北农业大学本科毕业论文1壤取 1g 放入到装有 10mL 蒸馏水的试管中，依次在前边一个试管中取 1mL 加入后一试管中做梯度稀释，直到最后一试管。 （每次做梯
7、度稀释时都要将前一个试管中的菌液混匀）2.3.培养基的配置2.3.1.培养基的原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料.由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等.另外,培养基还应具有适宜的 pH 值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压.2.3.2.培养基配置的步骤流程：称药品溶解加牛奶调 pH 值倒平皿根据培养基配方依次准确称取各种药品,放入适当大小的锥形瓶中。用量筒取一定量蒸馏水倒入锥形瓶中,搅拌混匀，
8、使琼脂或蛋白胨等药品完全溶解，用透气滤纸塑料膜封口，放在微波炉中加热，注意控制温度不要使培养基溢出或烧焦。待完全溶化后取出冷却到 50左右，加入牛奶混匀。后根据培养基对 pH 的要求,用 5%NaOH 或 5%HCl 溶液调至所需 pH.测定 pH 可用 pH 试纸或酸度计等（此步骤可以省略） 。在温度没有下降到培养基的凝固温度时快速将锥形瓶中的溶胶物质分倒入到准备好的平皿中，编号 110。将试管中的菌液分别取 200L 分别涂布到对应编号的平皿中。 （涂布菌液要均匀，尽量将菌落分开）2.3.2.1.注意事项此步骤中凡是灭菌的实验用品都要在无菌环境中操作（例如涂布和倒平皿等步骤） ，可以在超净
9、工作台中操作，也可以在酒精灯火焰附近的无菌区操作。倒平皿时当溶胶物质覆盖平皿底部 3/4 时即可，不宜太多，后通过其流动而均匀覆盖整个平皿底部。2.3.2.2.微生物培养的方式浇注平板法和涂布平板法。2.4 菌株的培养将平皿倒置放入恒温培养箱中，设置温度 37，恒温培养 45d。培养时间到达时将培养皿取出，观察各个培养皿中的菌落，菌株旁边有透明圈的即为蛋白酶菌落。 （此蛋白酶菌因为有分解蛋白质的能力，所以将其周围的牛奶分解利用而形成了空圈）选择菌落直径足够小，分解蛋白的透明圈足够大，即透明圈与菌落圈的直径比最大的菌落作为后续实验所用或者作为工程菌来培养，其分解蛋白的能力最强。河北农业大学本科毕
10、业论文12.4.1.菌种的初步筛选根据平板颜色反应直接挑选：透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶） ；抑菌圈法（抗生素） ；变色圈法（柠檬酸） 、显色圈（氨基酸） ；沉淀圈法（外毒素） 。透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初步筛选指标）2.4.2.注意事项微生物培养时培养皿一般要倒置，主要是减少水分散失,避免培养基的成分（盐分等）浓度变大,渗透压发生变化不利于细菌生长.培养皿倒置也可以减少操作过程中落入平皿内的灰尘细菌植入培养基而发生污染.另外,培养皿倒置取出时不容易脱盖（尤其是若干个培养皿叠放的时候） ，防止不小心的污染。2.4. 划线接种分离纯化取准备好的牛肉膏蛋白胨培养基，用接种
11、环无菌操作挑取能分解蛋白质的菌落分区划线。先在培养基的一边作第 1 次平行划线 34 条，再转动培养皿约 60角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第 1 次划线部分作第 2 次平行划线，再用同法通过第 2次平行划线部分作第 3 次平行划线和通过第 3 次平行划线部分作第 4 次平行划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置放入恒温培养箱中培养 45d。培养结束后取出，第四次划线部位出现的单个细菌形成的菌株就是纯化的菌体。3.蛋白酶菌种的紫外线诱变3.1.实验目的了解诱变剂对微生物的杀菌和诱变的双重生物学效应；学习紫外线诱变的方法级测定诱变剂最适量的方法。3.2 实验原理基因突变可分为自然突变和诱变突变
12、，许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，能使突变率提高到自发突变水平以上的因素成为诱变剂。3.2.1 紫外线诱变紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素，UV 的生物学效应主要是它能引起 DNA的结构变化。紫外线的波长在 200380nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有 80%是 254nm。DNA 损伤或突变后，可被光激活酶所修复，故一般要求操作应在红光下进行，处理后在暗处培养。随着照射时间的增长，杀菌率和突变率随之提高，但照射时间继续增加到河北农业大学本科毕业论文1一定程度时，其杀菌率随之增大，而突变率却降低。紫外线
13、照射剂量、强度单位为尔格/mm，由于测定困难，在实际诱变育种中常用 UV照射时间或致死率表示相对剂量（其中以致死率表示具有实际意义） 。3.3.紫外线诱变的流程出发菌株（纯化）前培养期（培养至对数期）离心、洗涤菌悬液制备诱变处理（活菌计数）取样稀释涂板（培养基提前制好）避光培养菌落计数出发菌株的来源可以是野生型菌株，本实验采用上一步骤纯化的蛋白酶菌株，用接种环挑取一定量的菌接种到有 LB 培养液的试管中，放到摇床中 37培养 1d 左右培养到对数期。8000r 离心 5min，弃上清，用缓冲液或者灭菌蒸馏水重悬洗涤，离心，弃上清，重悬到盛有灭菌水的培养皿中。取 50 支试管，分为 5 组，组内
14、试管都需要编号 110，组别试管编号一五组，所有试管中都加入 9mL 灭菌蒸馏水。第五组试管作为对照组，其中第一号试管直接取 1mL 没有诱变的菌液，做梯度稀释，取 10-5,10-6,10-7,10-8 试管中的菌液 200L 涂板，每个稀释梯度涂布两个培养皿，并作标记。第一组到第四组的菌液诱变时间分别是 30s，60s，90s，120s，其涂板稀释梯度为 10-510-8，10-410-7，10-410-7，10-310-6，分别取菌液 200L，每个培养皿涂布两个培养皿并作标记。从诱变后开始的操作全部在红光下操作，而且要求无菌环境，后将培养皿倒置叠放在黑色塑料袋中放入恒温培养箱中培养 4
15、5d。将培养皿取出，计数每个培养皿中的菌株的数目即 CFU 数，求出每个时间诱变后和诱变前的单位体积（m L）存活菌数。3.4 制作剂量存活曲线以照射时间为横坐标，以致死率为纵坐标，突变率为最高值，相应的致死率即为最适剂量。致死率（%）=（对照每毫升 CFU 数-处理后每毫升 CFU 数）/对照每毫升 CFU 数*1004.菌种的鉴定4.1.革兰氏染色用接种环挑取纯化菌株中的菌制成菌悬液，在载玻片上滴一滴菌液，再滴一滴大肠杆菌液作为对照（革兰氏阴性杆菌） ，结晶紫 1min，自来水冲洗，加碘液覆盖涂面染色1min，95%乙醇数滴，并轻轻摇动进行脱色 2030，水洗吸去水分，番红复染 23min
16、，自来水冲洗，自然干燥，滴松柏油显微镜下油镜观察。本试验观察的待测菌显色为紫色，是革兰氏阳性杆菌，大肠杆菌显色红色，印证阴性反应。4.2.动力试验（半固体）4.2.1.原理河北农业大学本科毕业论文1培养基为胰蛋白胨的半固体培养基，有动力的细菌眼穿刺线扩散生长。4.2.2.过程配置培养基：根据培养基配方依次准确称取各种药品,放入适当大小的锥形瓶中。用量筒取一定量蒸馏水倒入锥形瓶中,搅拌混匀，在电磁炉上稍稍加热，使蛋白胨琼脂等充分融解，分装于三支无菌玻璃试管中，垂直待其冷凝。操作步骤：用接种针挑取待测细菌，然后垂直从半固体琼脂表面插下去，插到离试管底部只有 5mm 左右时再垂直抽回来，即做一条刺线
17、，培养 48h 后观察结果。本试验待测菌种没有在琼脂表面以下生长，认为此菌种为严格好氧菌。4.3.VP 试验根据培养基配方准确配配制培养基，分装于三支试管中，培养 48h 后，加入甲液0.5mL，加入乙液 0.2mL（40%KOH） ，观察结果。本试验培养基显色为红色，阳性。4.4.蔗糖、葡萄糖、甘露糖培养基试验除甘露糖培养基外，根据培养基配方准确配配制培养基，分装于三支试管中，引入菌种，培养 48h 后观察结果。本试验中培养基颜色由紫色变为黄色，菌种可以利用蔗糖和葡萄糖，阳性。甘露糖培养基中接种细菌，保鲜膜封口，培养 48h 后观察结果。本试验中培养基颜色由紫色变为黄色，阳性。4.5.淀粉培
18、养基试验营养琼脂加 0.2%可溶性淀粉配成的培养基浇注培养皿，接种待测菌种培养，培养一段时间后向菌落滴加碘液，观察结果。本试验培养皿上菌落旁出现空圈，说明细菌能够利用淀粉，阳性。4.6.柠檬酸盐利用试验根据培养基配方准确配配制培养基，分装于三支试管中，放置斜面，待其冷却后用接种环挑取细菌划线培养，一段时间后观察。如果菌落可以分解柠檬酸盐，则其产生碳酸盐，使培养基变为碱性，此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色，不能利用柠檬酸盐为碳源则不生长，培养基不变色。本实验培养基由绿变蓝，阳性。4.7.硝酸盐培养基试验根据培养基配方准确配制培养基，调节 pH7.4，分装于三支试管中，每支试管 5mL，引入细菌培养一段时间后，加入配套的指示剂甲液和乙液各一滴，观察结果。若细菌利用硝酸盐产生亚硝酸盐，则立刻或数分钟内显红色，为阳性反应；若不变色则为阴性反应，原因有三点：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适河北农业大学本科毕业论文1于细菌生长。本试验显红色，为阳性。4.8.菌种鉴定结果由以上试验结果可以在菌种鉴定手册中检索，大致确定其为枯草芽孢杆菌。参考文献1佚名，百度文库，http:/
