1、2008 届生物技术专业学士学位论文共 12 页 第 1 页白鲢疥疮病病原的初步分离与鉴定04 级生科系.生物技术：辛静 指导老师：孙翰昌英文摘要摘要：园林工程业是一个涉及面很广的行业，施工套图设计作为其中的一门学科，有着它独特的地位和作用，施工套图设计不但是施工企业投标的重要文件，而且是项目管理的总体规划。 既然它产生于计划经济时代，它就应该顺应时代的潮流，一改过去教条冗长的模式，真正做到与时俱进。要编制出切实可行合理的施工套图设计 (或方案 )应具备很多方面的知识，特别是实践中的经验，只有这样，才能编制出更 具有指导性的工程文件，用来指导施工。本次研究的内容包括以下几方面：广场景观方案的扩
2、初设计；花坛、树池等施工图设计；广场的绿化施工平面图设计；绿化附属工程施工图设计等。本次研究首先对现场进行踏勘法，对广场的绿化环境进行实地调查分析；再次对分析的数据以及资料等进行整理，归纳，以防遗忘那些较细小的却有较大影响因素的环节。在此基础上多思考施工图所表达内容的可行性，并画出构思草图，构思草图只是一个初步的规划轮廓，接下去要将草图结合收集到的原始资料进行补充，修改。研究中注意实际设计与理论研究相渗透，结合网络资源与相关专业人士交流学习,总结出最佳方案。关键词：施工图 研究 工程 绿化 Inition Isolaotion and Identification of Pathogen fr
3、om Silver carp with Scabies diseaseXIN Jing(Biological technology in 04 level of life sciences department)Supervisor: SUN Han- changAbstract:Two strains of bacteria (CQWL-1 and CQWL-2)were isolated from skin organization of Silver carp with Scabies disease,and the bacteria CQWL-2 was identified as V
4、ibrio fluvialis through morphological characteristics and biochemical experiments of bacteria.The physiological and biochenical characteristics showed that the isolated organism was gram negative,motile;The drug sensitive test showed that the isolated strain was senstive 2008 届生物技术专业学士学位论文共 12 页 第 2
5、 页to Ciprofloxacin, Levofloxacin, Chloramphenicol,Furazolidore, Nitrofurantoin, Norfloxacin, Fortum, medium sensitive to cefoperazone,Sulfamethoxazole,and resistant to Penicillin G, Amoxicillin, Ampicillin, Imipenem,Oxacillin. Furthermore,we have an artificial bacteria infection tese,Artificial infe
6、ction tese by injecting intramuscularly with a concentration 108CFU/mL to health fish showed that subjected fishes appeared similar symptoms as the naturally affected fishes did and dead 100.It was proved that the isolated bacterium is a pathogen for Symptoms ocellatus.Key words:Vibrio fluvialis;Sil
7、ver carp;Scabies disease;pathogen;isolation; identification 引言：水生动物存在病毒病、细菌病和寄生虫病等。病毒病的病原体微小，在宿主细胞内复制，潜伏期长短不一、症状复杂多变、传染性强、死亡率高，严重危害水生动物的养殖，造成巨大的经济损失。迄今已发现的鱼类病毒有 70 多种 1。在研究初期，仅能对疾病的症状进行描述，随着研究的深入，逐步走向以“病原”为主的研究。因此，从病鱼中分离、鉴定病原微生物的研究对其相关疾病的防治有及其重要的作用。白鲢（Silver carp）是我市及全国淡水主养品种，养殖产量约占全市淡水鱼产量的一半。近年来，由于
8、养殖的快速发展和养殖规模的扩大，造成了遗传污染和渐渗现象严重，致使抗逆性、生长快等优良种质性状逐渐下降，养殖生产病害频繁发生，品质下降，养殖生产效益大大降低，严重影响了养殖业的发展。科研人员和养殖者已认识到了这一问题的严重性，并广泛开展了水产良种选育和优良品质的开发和利用；同时，一些科研人员对患病白鲢的致病菌也进行了相关研究，但这方面的报道较少。直到 2007 年 6 月，唐毅等 2从患病白鲢中分离出肺炎克雷伯氏菌（Klebslella Pneumoniae） 。2007 年 10 月，本人从永川双竹渔场获得一条患病白鲢，并对其病原进行了初步分离和鉴定，最终分离出一株河流弧菌；同时，对该菌还进
9、行了药敏实验和毒力性实验。本研究旨在分离危害重庆市养殖白鲢的细菌性疾病的病原,为寻求有效的防治措施提供基础资料。1 材料和方法1.1 实验鱼患疥疮病的白鲢于 2007 年 10 月 28 日星期天采自重庆市永川双竹渔场。体长 1420 cm，病鱼表现为体表溃烂，鱼体两侧有出血点，腹部、鳍基部、眼下眶充血。1.2 实验前准备培养皿、试管等若干清洗并高压灭菌，放置于紫外超净工作台备用。将患病白鲢洗净，置于冰箱中备用。1.3 LB 固体培养基的配置 3蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，Na 10 g，琼脂粉 15 g，溶于 800 ml 水中，用 NaOH 调 pH 到 7.0，定容到 1000 m
10、l，1.05 kg/cm 2（121.3）灭菌 30 min。1.4 病原菌的分离2008 届生物技术专业学士学位论文共 12 页 第 3 页在无菌条件下即已灭菌的紫外超净工作台上，用 70 %酒精消毒鱼体表面,直接取溃烂的皮肉组织于无菌研钵中并加入少许无菌水将其捣碎，划线接种于 LB 固体培养基平板上，置 28恒温培养箱中培养 24 h。从平板上选取优势菌落进行纯培养，等培养至 35 代后可获得形态一至的纯菌落，挑取单个菌落经涂片、染色、镜检，证实为纯培养物。挑取其中单个优势菌落，保存在 LB 固体培养基斜面上，或 10甘油无菌生理盐水中-80冰箱保存，备用。1.5 菌落及形态学观察用获得的
11、纯培养物接种于 LB 固体培养基平板，置于 28恒温培养箱培养 24h，然后观察菌落的形态。将获得的纯培养物参考周德庆主编微生物实验手册 4中的实验方法对其进行涂片，固定，革兰氏染色后镜检。1.6 病原菌的鉴定对所分离出的菌株由永川免疫防御中心帮忙鉴定。他们采用的是 API 细菌数值鉴定系统。这是一种能同时测定 20 项以上生化指标，因而可用做快速鉴定细菌的长形卡片（21 cm4.5 cm,法国生产） ，其上整齐的排列着 20 个塑料小管，管内加有适量糖类等生化反应的干粉（有标签表明）和反应产物的显色剂。每份产品都有薄膜覆盖，保证无杂菌污染。使用时，先打开附有的一小瓶无菌基本培养基（液体） ，
12、用于稀释待鉴定的纯菌落或菌苔。实验时，先把制成的浓度适中的细菌悬液吸入无菌滴管中，待撕开覆盖膜后，一一加入到每个小管中（每管约加 0.1 mL） 。一般经过 24 h28 h 保温后，即可看出每个小管是否发生显色反应，并将结果记录在相应的表格中，再加上若干补充试剂，包括细胞形态、大小、运动性、产色素、容血性，过氧化氢酶、芽孢有无和和革兰氏染色反应等后，就可按规定对结果进行编码、查检索表，最后获得该菌种的鉴定结果。20 余年来，此系统已为国际有关实验室普遍选用。实用 API 系统鉴定的细菌有 700 多种，使用前可根据自己鉴定对象去选购相应系列的产品，例如，肠道菌鉴定可用“API-20E” （“
13、20”指试管数， “E”指肠道细菌） ；厌氧菌可用“API-20A” （“A”指厌氧菌，故接种后应放在厌氧罐中培养）；等等。1.7 药敏实验药敏实验采用纸片法，选用了生产上常用的 14 种药物进行试验。按实验操作要求先将细菌进行培养，用无菌生理盐水洗下后吸取 0.2 mL 菌液于 LB 固体培养基平板上均匀涂布，贴上药敏纸片，每种药敏片设 4 个平行实验，于 28恒温培养箱中培养 24 h，然后观察有无抑菌圈产生，并记录抑菌圈直径，计算平均值。再重复做一次实验。最后根据抑菌圈直径比照判断标准（现代诊断学手册 5抑菌圈直径 d15 mm 为高度敏感、15 mmd10 mm 为中度敏感、d15 m
14、m 为高度敏感、 15 mmd10 mm 为中度敏感、d10 mm 为抗性即不敏感2.5 人工感染实验结果用 CQWL-2 菌株对健康白鲢进行注射感染，当注射液浓度为 107 CFU/mL 时死亡率为3070，注射菌液浓度为 108 CFU/mL 时，死亡率为 7090, 注射菌液浓度为 109 CFU/mL时,死亡率为 100。结果见表 3。表 3 分离菌 CQWL-2 感染实验结果Tab.3 Result of challenge tests of isolated strain CQWL-2菌名菌液浓度（CFU/mL）注射剂量（mL）注射鱼数（尾）死亡鱼数（尾）死亡率（）CQWL-2 1
15、07 0.2 10 3 30CQWL-2 108 0.2 10 7 70CQWL-2 109 0.2 10 10 1002008 届生物技术专业学士学位论文共 12 页 第 9 页CQWL-2 107 0.2 10 7 70CQWL-2 108 0.2 10 9 90CQWL-2 109 0.2 10 10 100对照 生理盐水 0.2 0 0 0人工感染后发病鱼的主要症状为：食欲下降甚至停食，体色变黑，离群独游，游动缓慢，对外界刺激不敏感，鱼体两侧有出血点，皮肤腐烂，背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血，解剖腹腔、肠道微红、壁薄、少韧性易拉断，肝脏腿色，肠壁充血。与自然发病的症状基本相同。重复感染
16、实验结果相似。据此可确认该分离菌 CQWL-2 为致病菌。3 讨论从患病白鲢溃烂的皮肉组织中分离到的 CQWL-1 菌株呈明显的革兰氏阴性杆菌，菌落呈圆型，小而薄，表面光滑、湿润、较粘稠，色泽均匀、呈白色，半透明，易挑取；而从相同部位分离的CQWL-2 菌株呈明显的革兰氏阴性弧菌，菌落近似圆型，大而扁平，表面光滑、湿润，质地均匀，其颜色近似黄色，不透明，易挑取。从菌落形态中可以看出，CQWL-1 符合一般性细菌的菌落特征，比较大众化，可能为常见的某种细菌，如乳杆菌和肠杆菌等，一般无致病性；而 CQWL-2 的菌落形态比较特别。再加上做实验的时间也比较紧促，故我们只对 CQWL-2 进行了比较详
17、细的鉴定。对 CQWL-2 的鉴定主要采用 API 细菌鉴定系统鉴定其生理生化特征。API 编码是一种国际公认的细菌鉴定手工检索编码，在国内也拥有众多的用户。但目前在国内 API 编码系列中没有单独的“弧菌科细菌鉴定编码” ，而是将弧菌归属于肠道菌鉴定系统(E 系列) 或与非发酵菌共同归属于非肠道革兰阴性杆菌鉴定系统(NE 系列) 。本次实验采用的就是 API-20E 试剂条，最后鉴定得出的生化谱为可以生化谱，鉴定此菌即 CQWL-2 可能为河流弧菌，其鉴定值为 89.8。因为准确鉴定值一般为 92.9以上，故在前实验的基础上又做了一些补充实验。例如：做了氧化酶试验，七叶灵水解试验，弧菌抑制剂
18、 0/129 反应试验，葡萄糖生长试验，甲基红试验，并结合所观察到的菌落形态特征以及参考伯杰氏细菌鉴定手册 ，增强了鉴定结果的准确性。根据实验结果鉴定该分离菌为河流弧菌（Vibrio fluvialis） 。弧菌是海水环境中的正常菌群，广泛分布在自然海区中，一般情况下不会引起养殖动物发生病害，但在养殖海域环境条件恶化引起这些条件致病菌大量繁殖，而养殖动物抗病力低下的情况下就会爆发弧菌病。近年来也有不少研究者对致病性弧菌作了相关报道 7-11。在众多类型的弧菌中，不少研究工作者对河流弧菌进行了相关性研究。2003 年纪荣兴等 12进行了美国红鱼“腐皮病”病原的初步研究，并发现其致病菌为河流弧菌。
19、2003 年 B. D. Tall 等 13发现河流弧菌能够导致龙虾患瘫软病。但有关病害研究的报道中，尚未见河流弧菌对淡水养殖白鲢引起疾病的研究，本分离菌用人工感染可使健康白鲢发病死亡，且疾病症状与淡水养殖白鲢自然发生的疾病症状相似，可以证实该菌为患疥疮病白鲢的病原菌。同时，人若误食一些被河流弧菌污染的食物也会出现一些不良的症状，对于此，国内也有一系列的报道。例如：2004 年，俞青等 14在一起食物中毒事件的调查中发现，河流弧菌能够引起人类恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热等症状。而且，潜伏期最短 9 小时左右，最长 26 小时 30 分钟，平2008 届生物技术专业学士学位论文共 12 页 第
20、10 页均潜伏期 15 小时。因此，经本次实验鉴定出白鲢疥疮病病原为河流弧菌后，也给人们起到一个警示作用，防止一些小贩贪图利益低价销售而给市民带来不良的后果。白鲢是我国的主要淡水养殖之一，因此对白鲢疾病的防治成了养殖人员和科研人员的主要研究对象。近年来，对白鲢某些疾病的防治也有不少报道 15-16。本人对研究对象患病白鲢的病原菌即河流弧菌进行了 14 种药物的敏感性检测，其结果表明，仅少数几种药物对该菌有明显的抑制作用，如：环丙沙星、左氟沙星、氯霉素、痢特灵、呋喃妥因。而其他大部分药物对其不敏感或作用不明显，这可能是生产上经常使用这些药物，使细菌产生了抗药性。因此，在防治该病时，药物选择必须慎
21、重，切忌滥用抗生素。无根据地乱用药物只会加速该菌的耐药性，破坏养殖环境微生物的平衡乃至破坏整个养殖环境。从人工感染实验结果来看，10 9 CFU/mL 浓度注射的白鲢死亡率是 100，10 8 CFU/mL 浓度注射的白鲢死亡率是 7090，而 107 CFU/mL 浓度注射的死亡率只有 3070。因此，控制该菌在养殖水中的数量对防治和该实验中患病白鲢相似症状的疾病是有一定意义的。参考文献：1 刘新建,李贵生.国内鱼类病毒病研究进展J. 生态科学 .2004,23(3):282285.2 唐 毅,张 芬,孙翰昌 ,等.白鲢肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定J.西南大学学报(自然科学版),2007,29(
22、6):73 76.3 蔡信之,黄君红主编.高等学校教材微生物学M. 高等教育出版社 .2002.12405.4 周德庆主编.微生物实验手册M. 上海科学技术出版社 .1983.14162.5 王淑娟.现代诊断学手册 M.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1995. 511525.6 RE 布坎南,NE 吉本斯等编.伯杰细菌鉴定手册M(第八版).北京:科学出版社,1984.382533.7 毛芝娟,刘国勇,陈昌福. 大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴定J. 安徽农业大学学报,2002, 29 (2): 178181.8 Kusuda R, Salati F. Major bacter
23、ial diseases affecting mariculture in JapanJ. Ann Rev Fish Dish, 1993(4):69859 吴 斌,马 杰,林维宣.水产品中致病性弧菌的分离与鉴定J.大连轻工业学院学报,2003, 22(1):4749.10Sakata T,Hattori M. Characteristics of Vibrio vulnificusisolated from diseased tilapiaJ.Fish Pothol,1988,23(1):334411石亚素,童国忠,薛超波,等.舟山养殖大黄鱼烂尾病中哈氏弧菌的分离鉴定及药敏试验 J.中国卫生
24、检验杂志,2005,15(3):267269.12纪荣兴,胡石柳,邹文政,等.美国红鱼“腐皮病”病原的初步研究J.海洋科学,2003, 27(8) :14.13B. D. Tall,S. Fall,M. R. Pereira,等. Characterization of Vibrio fluvialis-Like Strains Implicated in Limp Lobster Disease J. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(12):74357446.14俞 青,李东松,王志浩,等.一起河流弧菌引起的食物中毒调查分析J.江苏预防医学,2004,
