分子生物学复习.ppt

转录、逆转录及翻译的比较,,,,,,,,,,,小 结,DNA重组/ 基因重组,利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。,DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克隆,将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。,（一）基因（gene） 基因 从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。 （二）基因工程（genetic engineering） 基因工程 有目的的通过分子克隆技术，人为操作改造基因，改变生物的遗传性状的系列过程，总称为基因工程。,重组DNA技术操作过程可形象归纳为:,2.利用相同的酶切位点—双酶双切点（定向克隆） 优点（1）避免载体/目的基因的自身环化；（2）可控制外源基因插入方向。 （3）单拷贝插入。（4）提高连接效率 构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。如：目的基因和载体都有EcoRⅠ，PstⅠ酶切位点，产生各自互补粘端，分别配对连接。,核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。,探针：用于检测的带有标记的已知核苷酸片段。,核酸分子杂交：具有同源性的两条核酸单链在一定条件下,按碱基互补配对原则形成完整或局部互补双链的过程。,探针：用于检测的带有标记的已知核苷酸片段。,五、分子杂交的过程,1、印迹：把待测的DNA或RNA 转移到固相支持物上的过程。,,Southern印迹：转移DNA。,Northern印迹：转移RNA。,,Southern blot,提取基因组DNA 定量：1 OD260=50 µgDNA 酶切 进行1%琼脂糖凝胶电泳,,正常人,病人,,,,,,,,,,,,,,,按分子大小分离,变性：NaOH 中和：Tris.cl （pH 8.0）中和强碱,转移到固相支持物上,,虹吸法 电转移法 真空转移法,Northern blot,提取RNA,注意事项：,避免外源性RNase的污染,用新的离心管等都是的，高压灭菌的 干净的玻璃器皿 戴手套操作 试剂用DEPC处理的高压灭菌的三蒸水配试剂 0.1%焦碳酸二乙酯（100 ml水中加入0.1 g）,37 ℃过夜后,高压灭菌,避免内源性RNase的污染,应用RNase抑制剂：RNasin（特异性抑制剂） 应用蛋白变性剂：酚、SDS、氯仿 其他：硫氰酸胍，异硫氰酸胍（非特异性抑制剂）,RNA定量,定量：1 OD260=40 µgRNA 纯度：OD260/OD280 > 1.8 完整性：电泳,,,,,,,,,,,,完整,部分降解,全部降解,28s 18s 5s,变性电泳,1%琼脂糖甲醛变性电泳： 1%琼脂糖30 ml，60 ℃时加入1.62 ml甲醛原液  （37%），再加入EB，灌胶，走电泳。 甲醛可使RNA局部的双链打开,二极结构解体,泳动时严格按照分子质量大小分级.,转膜：任选一种 固定 保存备用,探针标记,基因组DNA探针：酶切基因组DNA，得到某个片段； 克隆化的各种基因片段。 含内含子，不适用Northern杂交,cDNA探针：只含外显子，Southern、Northern都可用。 RNA探针：单链，不用变性，特异性高，本底低，但易降解。 寡核苷酸探针：人工合成的一小段核苷酸序列，15-30 bp，简单，  杂交时间短，适用于点突变分析， 但标记物掺入少，灵敏性差。,标记方法,切口平移法,得到的探针是片段,注意事项：,一定是α32P，因为掺入的是α位的P，而不是β、γ位的P。 用DNApolⅠ（不能用Klenow片段，因为没有5’ 3’外切活性) DNaseⅠ浓度：太多,易切碎;太少片段大,但标记物掺入率低。 反应温度：14-16 ℃。 标记的是双链。,,,随机引物法,,随机引物：4种碱基按照6或8个长度随机组合得到所有寡核苷酸片段。,得到的探针也是片段，其长度与随机引物的长度有关。,注意事项：,标记的链是新合成的链，对母链没有进行标记。 避免了DNaseⅠ加入量的不确定。 现用现标，不要放置时间过长,因为高放射性破坏DNA链。 可标记双链、单链DNA或RNA。,3‘末端标记法,,标记的是双链，不破坏完整性。,（酶切后必须是3’凹陷）,注意事项：,根据不同的酶切位点选择不同的标记核苷酸。 例如：EcoRⅠ位点 5’GAATTC 3‘CTTAAG 不能用于3’凸端的DNA标记。 一般两端标记，否则标记量太少。,5’AATTC,3‘TTAAG,5‘末端标记法,,,5‘,3‘,3‘,5‘,,碱性磷酸酶,,,,γ-32P-ATP T4DNA激酶,注意事项：,,只能选γ-32P-ATP，供能。 要求DNA纯度高，末端不能包裹蛋白。,聚合酶链反应(PCR)是 80年代中期发展起来的 体外核酸扩增技术。它 具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复 性好、易自动化等突出 优点；能在一个试管内 将所要研究的目的基因 或某一DNA片段于数小 时内扩增至十万乃至百 万倍,使肉眼能直接观 察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个 细胞中扩增出足量的 DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,六、引物的设计原则,引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合。 PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。,引物设计好坏与PCR结果密切相关,1、引物长度,一般为15-30个核苷酸，一般为20～27mer。 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,2、 （G＋C）含量,GC含量一般40-60%，一般> 50%。 引物Tm值一般要求：55℃-65℃。 对于低于20个碱基的引物，Tm=4(G+C)+2(A+T) 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性； GC含量太高也易于引发非特异扩增。,3、 碱基的随机分布,A 、T、 C、 G 4 种碱基随机分布 同一碱基连续出现不应超过4个,4、引物自身不应存在互补序列,引物自身形成发夹结构，会因空间位阻而影响其与模板结合。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。,ATACAGT— — —GTAT,5、两引物之间也不应互补,尤应避免3′端的互补，以防止引物二聚体的形成。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。,6、引物3′端,引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰。,7、引物5’端,引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列和保护碱基。 5’端的修改某个碱基，引入该位点的点突变。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,,,3’,5’,,3’,5’,,,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,,8、引物的保守性与特异性,保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，与非特异性扩增基因同源性应小于70％。,9、上游引物与模板一致，下游引物与模板互补,5′ATCGAT — — — CGTAA 3′,上游引物：,5′ATCGAT — — —3′ 20mer,下游引物：,5′TTACG — — —3′ 20mer,1、引物长度,一般为15-30个核苷酸，一般为20～27mer。 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,2、 （G＋C）含量,GC含量一般40-60%，一般> 50%。 引物Tm值一般要求：55℃-65℃。 对于低于20个碱基的引物，Tm=4(G+C)+2(A+T) 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性； GC含量太高也易于引发非特异扩增。,3、 碱基的随机分布,A 、T、 C、 G 4 种碱基随机分布 同一碱基连续出现不应超过4个,4、引物自身不应存在互补序列,引物自身形成发夹结构，会因空间位阻而影响其与模板结合。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。,ATACAGT— — —GTAT,5、两引物之间也不应互补,尤应避免3′端的互补，以防止引物二聚体的形成。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。,6、引物3′端,引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰。,7、引物5’端,引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列和保护碱基。 5’端的修改某个碱基，引入该位点的点突变。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,,,3’,5’,,3’,5’,,,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,,8、引物的保守性与特异性,保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，与非特异性扩增基因同源性应小于70％。,9、上游引物与模板一致，下游引物与模板互补,5′ATCGAT — — — CGTAA 3′,上游引物：,5′ATCGAT — — —3′ 20mer,下游引物：,5′TTACG — — —3′ 20mer,四、基因表达调控的研究技术 （一）核蛋白的制备（二次裂解提取核蛋白）,,上清是胞浆蛋白 沉淀是细胞核、细胞骨架,胞浆蛋白溶出,离心收集沉淀,收集上清 （ 含核蛋白）,破核膜 （NP-40打孔、高盐溶解）,破胞膜,,,,,电泳迁移率改变分析（ electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA ） 1.原理: 同位素标记的DNA片段与核蛋白提取物孵育一定时间,用电泳检测,当蛋白质与DNA片段结合后,分子量远远大于游离的核苷酸片段,其电泳迁移率下降,出现滞后条带。,,,Free probe,DNA-蛋白质 复合物,,,2.目的： 1）可检测目的基因调控序列是否存在反式因子的结合位点。 2）可检测核内是否存在与顺式作用元件结合的反式因子。 3.基本过程: 1) 提取核蛋白 2) 合成探针: 合成所需的顺式作用元件(8-12bp的DNA片段) 3) 标记探针: 末端标记(37℃,10分钟) 4) 结合反应: 核蛋白+标记探针室温反应30分钟 5) 电泳: 高压电泳,低温下进行 6) 放射自显影: -70℃,注意事项: 探针不宜过长, <200bp 必须做竞争抑制实验 核蛋白用量适中,一般 2~5ug 体系中加入dIdC 或鲑精DNA 探针用量1.0ng 电泳缓冲液的离子强度不能太强 电泳要在低温进行,,报告基因分析 报告基因: 编码可供检测的酶与蛋白质的基因。 可作为报告基因的条件: ① 编码产物的活性不受宿主细胞的干预。 ②编码产物在宿主细胞中不存在, 易于区别。 ③编码产物的活性的测定必须具有快速、简便、 灵敏度高、重复性好的特点。 常用的报告基因：氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、 β-gal、荧光酶基因(Luc),原理 ： 将顺式元件插入报告基因的上游, 导入细胞，检测报告基因的活性，证明顺式元件是增强子还是启动子。,,报告基因,,插入的顺式元件,载体类型： 1）basic 载体：不含 P/E, 用于检测启动子活性 2）control载体：含启动子，用于检测增强子或 沉默子的活性。 实验技术： 基因重组 转染细胞 产物检测,DNase Ⅰ足纹法： 是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点的实验方法。 原理及操作过程： DNA结合蛋白与其特异的DNA序列结合，可保护其结合序列免受 DNase Ⅰ的作用。,首先将待测双链DNA片段中的某一条单链的一端进行标记，然后用适当浓度的 DNase Ⅰ与其作用，使DNA双链上形成随机的切口，经变性电泳分离和放射自显影后，在X光片上可见只差一个碱基的梯形DNA条带。但当DNA结合蛋白与标记的DNA作用后，结合的序列未受DNase Ⅰ的作用，因而在放射自显影图谱上就形成一个空白区。,2. 注意事项： 1）DNase I 消化后，需要充分除去反应中的蛋白质。 2） DNase I 的用量是关键，其 终浓度为0.1~1.0 ug /ml。 3）核蛋白提取物最好进行部分纯化。 4）确保只有一条链的5’ 或3’ 端被标记 。 5）进行化学测序可直接读出被结合的精确序列。,甲基化干扰足迹法 甲基化干扰法原理与DNase Ⅰ足纹法正好相反，即DNA先用甲基化试剂进行随机修饰，然后用DNA结合蛋白与此DNA进行结合反应，由于被修饰的DNA结合位点，不能与DNA结合蛋白结合，这样就可以分离并回收结合和未结合蛋白的DNA，并用特殊方法将DNA从被修饰的碱基处进行切割，而结合蛋白的DNA由于未被修饰而不能被切割，但结合位点外的被修饰区域仍有切割，这样结果与DNase Ⅰ足纹法相同，在结合位点形成一个空白区。,,染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP） 是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想方法，相对于传统的其它研究蛋白与DNA相互作用的方法（比如EMSA， electrophoretic mobility shift assay），ChIP技术能更加真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。,主要步骤： 第一步，在甲醛固定后分离和破碎染色质； 第二步，使用感兴趣的蛋白的抗体完成特定染色质片段的免疫沉淀； 第三步，分析免疫沉淀片段以确定出靶标DNA是否与感兴趣的蛋白结合。,,免疫沉淀 抗DNA结合蛋白的抗体,解除交联 抽提基因组DNA,,定量PCR检测,,,