1、研究生课程论文20142015学年第一学期蛋白质分离纯化技术的现状与发展研究生提交日期2015/1/17研究生签名学号201420123151学院轻工与食品学院课程编号S0832050课程名称高级食品化学学位类别硕士任课教师、教师评语成绩评定分任课教师签名年月日蛋白质分离纯化技术的现状与发展摘要蛋白质在细胞中的含量极低，将其从复杂的体系中分离出来并保持一定的活性，难度较大，因此分离纯化蛋白质的方法备受生命科学领域关注。本文主要综述了蛋白质各种分离纯化技术，以及相关的应用现状，讨论各种方法的特点与应用局限，并展望蛋白质分离纯化的前景。关键字蛋白质提取分离纯化应用ABSTRACTPROTEINHA
2、SAVERYLOWLEVELINTHECELLSITISVERYDIFFICULTTOBESEPARATEDFROMTHECOMPLEXSYSTEMANDKEEPITSACTIVITYSOTHEMETHODSOFSEPARATIONANDPURIFICATIONAREPAIDCLOSEATTENTIONTOBYTHELIFESCIENCETERRITORYPROTEINSEPARATIONANDPURIFICATIONTECHNIQUESWERESUMMARIZEDDISCUSSEDTHETECHNICALCHARACTERISTICSANDAPPLICATIONLIMITATIONOFMET
3、HODS,ANDTHERELATEDAPPLICATIONSTATUS,DISCUSSTHECHARACTERISTICSANDLIMITATIONSOFTHEVARIOUSMETHODSOFAPPLICATIONANDPROSPECTPROTEINSEPARATIONANDPURIFICATIONKEYWORDPROTEINISOLATIONPURIFICATIONAPPLICATION蛋白质的生物体的生命活动过程中，起着必不可少的作用，特别是一些具有生理活性的蛋白质，而这些具有一定特殊功能的蛋白质通过各方面的生物学技术以逐渐在医疗和食品方面等得到应用。但许多功能性蛋白质在细胞中的含量确实极
4、低的，要把这些蛋白质从复杂的体系中提取出来也是相当有难度的，再加上蛋白质本身具有的特殊性质，如（1）对温度、酸度、剪切力敏感，极易变性失活；（2）蛋白质产品在物料中含量低；（3）性质不稳定，易受料液中蛋白酶水解；（4）产品对蛋白质质量纯度要求高。因此，蛋白质的分离与纯化技术已成为当前生物工程的的热点问题。传统的蛋白质分离纯化方法主要有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、萃取、离子交换法等，这些技术无一例外过程都比较繁琐、耗时、损耗原料、能耗高。随着生物科技的飞速发展，出现许多高效的分离技术和手段，如高效液相色谱，毛细血管电泳，分子印迹法，大孔吸附树脂法，纳滤和超滤，联用技术等。文章针对近年来有
5、关蛋白质的分离技术所取得的进展做如下综述。1蛋白质的预处理在分离纯化蛋白质之前，需要将蛋白质从复杂的组织中分离释放出来，同时要保持蛋白质原有的结构性质与天然状态，仍然具有本身的活力。因此，蛋白质的分离要根据其本身的特性以及分离纯化蛋白质的原料的理化特征，选取合适的提取方式与溶剂，具有针对性的进行预处理。目前主要的预处理方式有水溶液提取法、有机溶剂提取法、酶法、超声波萃取法、双水相萃取法和反胶团萃取法。水溶液提取法一般用稀盐和缓冲体系的水溶液作为提取蛋白质的常用溶剂。一般而言，碱性蛋白利用偏酸性的提取液提取，酸性蛋白用偏碱性的提取液，提取温度一般为低温（4以下）操作，这视有效成分的性质而言。有机
6、溶剂提取法是利用一些与脂质结合的比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质如溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，用有机溶剂如乙醇、丙酮和丁醇提取。酶法相对于传统的碱法提取具有时间短、反应条件温和、不产生有害物质等优点，近年来，酶在蛋白质分离纯化中的应用非常广泛。在一般条件下碱性蛋白或碱性酶、肽类在酸性环境下比碱性环境下稳定，反之亦然。因此，在利用酶对蛋白质进行预处理时，要选择合适的酶以及操作环境，已达到较好的提纯效果。超声波萃取法是利用超声波波动与能量双重属性，破碎细胞（空化作用）和强化作用（机械作用），使细胞中蛋白质成分更好的释放出来。MOULTOU等1在对大豆蛋白的提取试验中发现，超声波提取法的蛋
7、白质提取率相对于水提法和碱法要提高23，且提取相同数量蛋白质所需要的的能量比传统分批提取节约30。双水相萃取法是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相，由于被分离的物在两相中分配不同，因而实现分离，龚丽芬2等以聚乙二醇、硫酸钠双水相体系分离提取琼脂糖和胃蛋白酶，结果发现胃蛋白酶的回收率为50。反胶团萃取是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时，自发聚集而形成一种纳米尺寸的聚集体，将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的3。程世贤4用反胶团提取大豆中的蛋白质和豆油，大豆蛋白质的萃取率最高达到969，豆油的萃取率为905。2蛋白质的分离纯化技术21沉淀法211盐析沉淀法盐析法是根据不同蛋白质和酶在一
8、定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用，沿用至今的方法。具有成本低，操作简单，对蛋白质生物活性有稳定作用等优点。一般粗抽提物常用该法进行粗分。212等电点沉淀法利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法。李殿宝5在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白质溶液的PH值调到34，使目的蛋白在等电点沉淀出来。213有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，另有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。利用不同蛋
9、白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法，常用于蛋白质和酶的提纯中。22层析法221离子交换柱层析离子交换层析（IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY,IEO）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子可逆交换是结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法,离子交换层析中，基质由带电荷的树脂或纤维素组成6。一般情况下，粗胶粒的离子交换剂用在提纯的前面步骤中，高分率的离子交换剂则用在纯化的后面步骤中。222疏水作用层析多数疏水性氨基酸藏在蛋白质的内部，也有一些在表明,蛋白质表面的疏水性氨基酸残基数目与按分布决定了该蛋白的是否具有与疏水柱
10、填料相结合从而利用它来进行分离的能力7。高浓度盐的水溶液中蛋白在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白从柱上被洗脱，因此特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后含有目标产品的溶液直接加样到柱上，也适用7MOL/L盐酸胍或8MOL/L脲的大肠杆菌治疗但阿比提取液直接加样到柱上，在分离的同时也对其进行了复性。疏水岑溪具有较少使多肽变性的特点8。223亲和层析利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异性识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱法。目前亲和层析技术已被广泛的应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。利用该法从粗提取液中经过一
11、次简单的处理便可得到所需的高浓度活性物质9。REDDY等10应用CIBACRONBLUE亲和层析的方法从心肌网状组织中提取了CA2腺苷三磷酸酶。224羟基磷灰石柱层析吸附剂羟基磷灰石可用于分离蛋白质和核酸。蛋白质中带负电荷基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合。而带正电基团与磷酸基相互作用，羟磷灰石对蛋白质的吸附容量比较大。因此，根据蛋白质分子与吸附剂羟磷灰石之间的吸附能力和解吸性质的不同而达到分离的目的。225凝胶层析混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的间隙最先流出柱外，分子量最小
12、的物质因能进入凝胶网孔而受到阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。作为一种快速简便的分离技术，由于设备简单操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，因此被生物化学、分子生物学、生物工程以及医药学等领域广泛应用。226置换层析作为一种非线性的层析技术，与传统的洗脱层析技术相比有明显的优点，即高上样量、高产率。高分辨率、及被分离样品在分离过程中的浓缩效应，这一技术已经越来越引起人们的关注11。研究表明，置换剂的相对分子质量越低，越容易与固定相结合，因此在分离相对分子质量较小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来12。227灌注层析灌柱层析（PC）是今年来新发现的一种层析技术，主要
13、利用分子筛原理与高速流动的层析模式，其特点是含有双空结构，不仅含有大量的常规层析介质的微孔，而且还含有纵横交错贯穿介质的“大孔”，流动相速度和孔径大小直接影响分离效果。目前，PC技术代替传统层析技术为世界著名制药工业及科研机构创造了更多成功的机会，我国在利用PC分离生物活性多肽，筛选生物活性先导化合物方面起步较晚，仍有很多工作有待今后的研究，其发展前景十分广阔。228金属离子亲和层析金属离子亲和层析（IMAC）是利用金属离子的络合或形成的螯合物来吸附蛋白质的分离系统。目前已经发现的金属离子如锌和铜，能够很好的与半胱氨酸的巯基及组氨酸的咪唑基结合，然后通过IMAC将这些含有不同数量基团的蛋白质进
14、行分离13。229免疫亲和层析免疫亲和层析（IAFC）是以抗体中的一方作为配基，亲和吸附另一方的层析方法14。与IMAC相比较，IAFC的专一性强、亲和力好、效率高、容量大。对目标多肽具有保护作用，分离时不易发生非特异性吸附，适合于分离低微量的样品。目前利用抗体抗原模式分离纯化蛋白质的研究较多。邓文涛等15利用亲和层析方法重组鲤鱼生长素（RCGH）。冯小黎等16采用合成的干扰素单克隆抗体高效液相亲和介质纯化由大肠埃希菌表达的基因重组人干扰素，纯化倍数达79倍，活化回收率为94。后来的研究发现这种亲和层析技术载体昂贵，机械强度低，配制困难，容易掺入杂志，所以有待今后改进。23离心法231速率区带
15、离心速率区带法是一次分离不同类型聚合物最有效的方法，是根据大小、性状的不同的颗粒在梯度液中沉降速度的不同建立起的分离方法17。离心前预先在离心管中装入密度梯度（如蔗糖、氯化铯），被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面，在离心力的作用下样品中各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与密度的福利相等时，颗粒就停留在该密度区域内，使各组分达到分离的目的18。如果离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳的分离时间，得到相当纯的细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题。232差速离心法差速离心是通过不断的增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度以及不停离心时间
16、下多次离心的方法，差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。在离心的同时需要控制好离心的时间和离心力的大小。离心力过大或时间过长，都容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤19。24色谱法目前，高效液相色谱法（HPLC）以其简便快捷、选择性好、分离效果好、检测灵敏度高及方法灵活等优势广泛应用于蛋白质的分离和检验中，近年来，由于色谱柱及色谱泵（可产生105MPA的压力）的改进而出现的特高效液相色谱（VHPLC），使的蛋白质的分离更加快速高效20。HPLC技术日趋成熟，已成为分离和检测蛋白质的重要工具。HPLC技术中，分配色谱、离子交换色谱、凝胶排阻色谱、疏水色谱、亲和色谱都能用于到蛋白质的
17、分离和鉴定。241反相高效色谱反相高效高效液相色谱法（RPHPLC）是目前在食品、医药、生物分析等领域应用最广泛的液相色谱法，已用于各种有机化合物的分离。根据蛋白质分子疏水性的不同，使其在两相中的分配不同而得到分离。在分离过程中极性大的组分先流出，极性小的后流出21。随着研究的深入，越来越多的小分子蛋白质和多肽已经能够使用RPHPLC进行分离分析。其中影响蛋白质分离因素主要有固定相组成及性质、流动相组成、洗脱温度、洗脱液PH值和流速等。张丽华等22研究表明，无孔径载体柱对分子量相差较大和疏水性很强的但阿比之混合物的分离效果很好。WALL等23利用C18非多孔硅粒载体柱实现了细胞啊溶菌物种蛋白质
18、的快速分离。242离子交换色谱高效离子减缓色谱（HPIEC）是最早用于蛋白质分离的一种方法，根据但阿比之分子在一定的PH值和离子强度条件下所带电荷的差异将其分离。当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，有与交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变PH值或离子强度的办法将吸附的蛋白质洗脱下来。这种技术已经成功的用于分离大多数水溶性蛋白质，包括水解以后的多肽乃至氨基酸，并且当选择的流动相PH值合适时能维持蛋白质的生物活性24。243凝胶过滤色谱，凝胶过滤色谱也称体积排阻色谱（SEC），是根据分子相对大小进行分离的一种色谱技术。体积排阻色谱也是一种温和的技术，可用于平衡柱及分离样品的
19、缓冲液范围较广。它对流动相选择的要求不高，适用范围广，但用HPSEC分离时，出峰的峰宽通常比较大，对于分子量差异较小的组分，分离度不高。近年来关于利用HPSEC分离蛋白质的报道较多，例如ROUFIK建立了用HPSEC分析多种乳清蛋白组成的方法，可以作为食品中添加乳清蛋白配方的依据25。如用乳白蛋白和酪蛋白制备血管紧张素抑制肽，在对乳球蛋白体外降解的组分进行分离分析时，采用HPSEC能够较好的保持产物多肽的物理化学性质。244疏水作用色谱高效疏水色谱是用来分离构相不稳定蛋白质技术之一，其分离机制类似于反相液相色谱，只是用水性冲液代替了有机溶剂。在以键合氟化物作固定相，用SDS（十二烷基硫酸钠）或
20、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）作流动相的胶束高效液相色谱中，胶束提供了一个溶质溶解的非均相环境，可用于蛋白质的分离26。蛋白质在分离过程中会重新发生折叠，因而在变性乳蛋白的检测中表现出优势27。近年来，科学工作者将非线性色谱理论应用于蛋白质的分离28。更加完善了高雄啊液相色谱技术。245高效亲和色谱高效亲和色谱（HPAFC）利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力（即生物学亲和力）建立起来的一种游戏哦啊的纯化方法，是一种高度专一的分离技术29。它通常只需要一步处理即可将目的蛋白从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化。也可以分离变性蛋白、化学改性蛋白等
21、30。近年来，HPAFC被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化。另外，由于融合蛋白质具有特异性结合能力31，因此HPAFC在分离纯化融合蛋白中发挥重要作用。25电泳法电泳为带电粒子在电场中向与其自身带电荷相反的电极方向移动的现象。蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。常用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，毛细管电泳在纯化蛋白的方面也得到了很好的应用32。翁瑜等用双向凝胶电泳比较3种常用蛋白质提取方法可以看出双向凝胶电泳的效果更好。251聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE具有三维网状结构，电泳颗粒
22、通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用，摩擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关33。可见杨平蛋白在电场作用下受到两种作用力，即静电引力和摩擦产生的阻力，而大大提高了电泳的分辨率。252等电聚胶电泳等电聚焦电泳是利用一种两性电解质为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的PH梯度，当带一定电荷的蛋白在其中用泳动时，到达各自等电点的PH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白。253印渍转移法生命大分子物质（如蛋白质）先经过电泳再印迹到固相载体表面上，经灭试剂处理后，可与相应的探针反应，接着用适当的溶液漂洗，置于含底物的溶液中培养，即可显出普带。如所用的探针是放射科同位素标记物时，则应将漂
23、洗后的载体进行放设自显影，即可检测出样品中特意的成分。254毛细血管电泳毛细管电泳（CAPILLARYELECTROPHORESISCE）是继高效液相色谱之后，将电泳技术和色谱技术相结合的一种新的分离技术，它是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术34。在高压作用下，带电粒子在毛细管内的溶液中迁移，迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和。各种粒子因迁移速度不同而实现分离，具有返利率高、快速、用量少等优点，是分离蛋白质及相关氨基酸和肽的有效工具。毛细管电泳在蛋白质分离分析中的应用包括肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备、以及蛋白
24、的定量测定、纯度检测、非均一性检测、稳定性和动力学研究。255毛细血管区带电泳毛细管区带电泳（CZE）需要的多肽量少，分离纯度高，而且只由带电性决定，因此分离准确度和效果超过一般的纯化技术35。但由于天然多肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发生反应，而使峰形和电泳的时间受到影响，因此根据分离多肽的性质，选用不同的分离条件减少吸附是今后的研究方向。256毛细血管凝胶电泳毛细血管凝胶电泳（CGE）是基于分子筛原理，采用十二烷基磺酸钠（SDS）处理蛋白或多肽，在电泳过程中主要依靠分子量和分子形状不同而分离。还有一种非交联、线性、疏水多聚凝胶柱被应用于多肽类物质的分离上36，此法多用于喊疏水侧链较多的肽的分离
25、。这种凝胶性质比较稳定，易于灌注，使用寿命长，但由于这种技术产生热量高，易导致生物活性肽失活，而且制备凝胶要求的精确度高，很难扩大规模，产业化困难，新型多肽电泳分离出哪壶技术有待未来研究开发。26膜分离261超滤超滤法（UF）是利用压力或离心力，使用一种特质的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的37。因此根据蛋白质大小的不同，选择不同规格的滤膜进行超滤，从而使蛋白质得到分离。樊晶等38应用萃取超滤两步法从过期人血中提取人血蛋白。262纳滤纳滤（NF）是一种介于反渗透和UF之间的分离方法，纳滤膜的孔径范围在几个纳
26、米左右，比UF的效果更好，可以完全出去细菌、胶体、铁锈、重金属等，不存在污染问题39。某些肽具有热敏性，受热易被破坏，并且采用传统的提纯方法不易除去低分子量的盐分，从而影响产品的纯度。因此采用NF分离是很好的选择，不仅能降低能耗，还可以将其中的有机污染物和盐分除去，大大提高了产品的品质。TIMMER等40那个各种聚合物超滤纳滤膜对氨基酸进行了分离测试，同时将其应用于混合氨基酸的分离。27反胶团萃取反胶团是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成聚集体。其中表面活性剂分子亲水基向内、非极性疏水基朝外，形成球状极性核，核内溶解一定数量水后，形成宏观上透明、均一热力学稳定的微乳装液，微观上恰似纳米级大小
27、微型“水池”41这些“水池”可溶解某些蛋白质，进而可以与周围的有机溶剂隔离，从而避免蛋白质失活，通过改变操作条件，又可使溶解于“水池”中的蛋白质转移到水相中，这样就实现不同性质间蛋白质的纯化与分离4243。反胶团萃取蛋白质时，水相蛋白分子进入反胶团微水相，此过程主要推动力是反胶团与蛋白质之间空间相互作用和疏水性相互作用对蛋白质的分配平衡也有很重要的影响44。前者主要取决于反胶团与蛋白质的相对尺寸45。因此，任何能引起静电力和反胶团尺寸增大的因素都有可能提高蛋白质萃取和分配系数，这些因素包括表面活性剂种类及浓度、离子强度、W0、助表面活性剂、水相PH值、温度等4647。3展望分离蛋白质的方法很多
28、，对于不同的目的产物，分离纯化的方法不同。盐析、离心、沉淀、双水相萃取技术往往只能获取粗产品，而运用凝胶、离子、亲和层析技术，可得到纯度较高的生物产品。虽然分离蛋白质的方法很多，但到目前为止，还没有找到一种简单、适用范围较广的方法能够将但蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但对任何一种蛋白都可根据其理化性能选择一套合适的分离提纯程序来获得高纯度的产品。根据目标产物的理化和生物学特性，选择合适的分离纯化工艺路线，提高目标产物的产率和纯度，以及较快发展蛋白质纯度的快速分析和活性检测技术，是生化研究工作者需要深入研究的课题。参考文献1MOULTONJ,WANGCAPILOTPLANTSDYOFCONTI
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42、JBIOTECHNOPROG,1985,1697445WOLLJM,HATTONTAYARMUSHMLBIOAFFNITYSEPARATIONUSINGREVERSEDMICELLAREXTRACTIONJBIOTECHNOLPROG,1989,5576246SHAHC,SELLAPPANS,MADAMWARDENTRAPMENTOFENZYMEACTIVEATLOWSALTINWATERRESTRICTEDMICROENVIRONMENTAMYLOGLUCOSIDASEINREVERSEMICELLESJPROCESSBIOCHEMISTRY,2000,35997197547FRUTOSCMARHUENDAEGEA,SONSOLESPIERAVELAZQUEZ,ETALANEXREMEHALOPHILICENZYMEACTIVEATLOWSALTINREVERSEDMICELLESJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,2002,932159164
