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实验四 碱性磷酸酶的动力学分析,酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素，并加以定量的阐述。
影响因素：酶浓度、底物浓度、pH、
温度、抑制剂、激活剂等。
在研究某种因素对酶促反应速度的影响时，
其余各因素均需保持恒定。,一、实验目的,1.掌握ALP活性测定的原理与方法
2.观察温度、pH、底物浓度、抑制剂对酶促反应速度的影响。
3.掌握双倒数作图法测定km值的原理与方法。,二、实验原理,1.温度对酶促反应速度的影响
2.pH对酶促反应速度的影响
3.底物浓度对酶促反应速度的影响
4.抑制剂对酶促反应速度的影响
5.酶活性的测定,1.温度对酶促反应速度的影响,温度对酶促反应速率具有双重影响
酶的最适温度
酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应所需时间有关,温度对淀粉酶活性的影响,2.pH对酶促反应速度的影响,酶促反应的最适pH
pH通过改变酶与底物分子解离状态影响反应速率
最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液种类与浓度、及酶纯度等因素的影响。,pH 对某些酶活性的影响,3.底物浓度对酶促反应速度的影响,当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两者成正比关系。
随着底物浓度继续增加,反应速度增加,而幅度不断下降。
若继续加大[S]，反应速度就不再增加,达到一个极限值Vmax。,底物浓度对酶促反应速度的影响,[S]与V的关系：米-曼氏方程,Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度
当[S]Km时， ，反应速率与底物浓
度成正比
当[S]Km时，VVmax，反应达到最大速率,Km与Vmax的意义,1. Km值
定义：Km等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。
意义：a)Km可表示酶与底物的亲和力
b)同一种酶对于不同底物有不同的Km值
c)Km是酶的特征性常数，只与酶的结构、底物和反应环境（温度、pH、离子强度）有关，与酶浓度无关
2.Vmax值：是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。,Km和Vmax值的测定,双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒数，得
以1/V对1/[S]作图，
得出一直线。,双倒数作图法,4.抑制剂对酶促反应速度的影响,酶的抑制剂：凡能使酶的催化活性下降而不引
起酶蛋白变性的物质。,竞争性抑制曲线图,竞争性抑制剂与酶的底物结构相似,与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶与底物结合成中间产物。,特点：
（1）V下降，发生抑制
（2）Vmax不变
（3）Km增大，亲和力下降,非竞争性抑制曲线图,抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合,不影响酶与底物的结合,底物与抑制剂之间没有竞争关系。但酶-底物-抑制剂复合物不能进一步释放出产物。,特点：
（1）V下降，发生抑制
（2）Vmax减小
（3）Km不变,反竞争性抑制曲线图,特点:
(1) V下降，发生抑制
(2) Vmax减小
(3) Km减小,抑制剂与酶和底物形成的中间产物结合，使中间产物的量下降。既减少从中间产物转化为产物的量，也同时减少从中间产物解离出游离酶和底物的量。,竞争性抑制作用,竞争性抑制剂与酶的底物结构相似，与底物竞争酶的活性中心，阻碍酶与底物形成中间产物，从而抑制酶的活性。,竞争性抑制作用,米氏方程,双倒数方程,竞争性抑制作用特点：,抑制剂与底物结构相似
两者都与酶的活性中心结合
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及抑制剂与底物浓度的相对比例，增加底物浓度可减低或解除抑制作用
动力学变化：Vmax不变、Km值变大,5.酶活性的测定,酶活性：是指酶催化化学反应的能力，衡量标准是酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度（V）：通常用单位时间，底物的消耗量或产物的生成量来表示，而一般测定时都是以产物的生成量为准。,磷酸苯二钠法测定ALP的活性,本次实验以磷酸苯二钠为底物，碱性磷酸酶(ALP)为催化剂，磷酸氢二钠作为抑制剂，分别观察观察温度、pH、底物浓度、抑制剂对酶促反应速度的影响。,磷酸氢二钠,醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值,计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）。,酚,Lambert-Beer定律：,100mL酶液在37℃下保温15min产生1mg酚为一个酶活性单位 。
从标准曲线查出释放出的酚量（µg）则可计算出酶活性,三、试剂和仪器,pH8.0、9.0、10、11.5甘氨酸缓冲液、
0.04mol/L底物
10mmol/L底物
4-氨基安替比林
0.5%铁氰化钾
酶液
0.5mol/LNaOH
pH8.8Tris缓冲液、
0.1mol/LpH10碳酸缓冲液
磷酸氢二钠
蒸馏水,四、操作步骤,1.温度对酶促反应速度的影响
2.pH对酶促反应速度的影响
3.底物浓度对酶促反应速度的影响
4.抑制剂对酶促反应速度的影响,五、结果与计算,酶活性的计算：在37℃下保温15min产生1mg酚为一个酶活性单位，从标准曲线查出释放出的酚量（µg）则可计算出酶活性。
100ml酶活性 = 释放出的酚量（µg）× 1/0.1
× 100 × 1/1000
= 释放出的酚量（mg）,六、结果绘图,1、绘出pH对反应速度的影响，标出最适pH。
2、绘出温度（T）对反应速度的影响，标出最适温度。
3、绘出1/[S]对1/[V]的直线图，求出Km和Vmax。
4、绘出有抑制剂Na2HPO4时1/[S]对1/[V]的直线图，求出有竞争性抑制剂存在时Km和Vmax的变化。,[作图],,,,,,,,,,,,,,,,-1/Km,根据图求得Km和Vmax,求出有竞争性抑制剂存在时Km和Vmax的变化。,,,1/Vmax,,,,,,,七、注意事项,1.试剂较多，看清楚名称和浓度，认真实验，取样要准确，加样顺序要一致，不能出错。
2.温度实验要保证温度。
3.作图时,实验点不在同一条直线上时,尽量使各点平均分布在直线的两侧,两图画在同一坐标纸上,便于判断。
4.每组做2个实验，数据交换使用。,
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