检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析.ppt

检验核医学,第五章 体外放射分析,概述,体外放射分析 体外放射分析是在体外条件下，以放射性标记物为示踪剂，以结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，在试管中进行的对体内微量活性物质进行定量分析的核技术的总称。 放射性标记物：*Ag、*Ab、*L、*S 特异性结合剂：Ab、R、E 分析对象：血液(血清、血浆)、尿液、 唾液、组织匀浆液、分离的组分,特点 1.灵敏度高 最小可测量为10-9-10-15g 2.特异性强 利用专一性强的结合反应 3.精确度好 有效的质量控制方法 4.放射性不引入体内 5.所需待测样品少 50-200l 6.试剂药盒化，操作简便、快速 7.测量微机化，方便、快捷，客观、准确,类型 竞争性体外放射分析 标记物 结合剂 放射免疫分析 *Ag Ab (RIA) 竞争蛋白结合分析 *Ag 血浆中固有的 (CPBA) 激素载体蛋白 (TBG) 放射受体分析 *L R (RRA) 放射酶分析 *S E (REA) 非竞争性体外放射分析 免疫放射分析 *Ab *Ab (IRMA) 受体的放射分析 *L R (RBA) 酶的放射分析 *S E (ERA),放射免疫分析(RIA),基本原理 1 RIA反应式 分离剂 *Ag + Ab  *Ag-Ab  *Ag-Ab  + 分离剂 Ag  Ag-Ab  Ag-Ab  1)一定量*Ag 、不定量Ag与限量Ab进行竞争抑制结合反应 2) *Ag-Ab 与Ag成负相关关系(反比) 3)在实际工作中，用一系列已知浓度的Ag(标准品)进行实验 制备剂量反应曲线(标准曲线， [*Ag-Ab] －[Ag]曲线)，未知 样品在相同条件下实验，其浓度通过标准曲线查出,,2 RIA数学函数式 k1 Ag + Ab  Ag-Ab k2 P + Q  PQ P = [Ag] + [*Ag] P0 = [Ag0] + [*Ag0] Q = [Ab] Q0 = [Ab0] PQ = [Ag-Ab] + [*Ag-Ab] k1 [PQ] [PQ] K = —— = ———— = ——————— (1) k2 [P] [Q] [P] ([Q0]-[PQ]) [PQ] = ——————— (2) ([P0]-[PQ]) [Q],将B = [PQ] / [P0]、B / F = B / (1-B) = [PQ] / [P]代入(1) B 1 K = ——— × ——————— (3) 展开重排 1 – B [Q0] - B [P0] [Q0] 1 [Q0] B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4) [P0] K [P0] [P0] 将B = 1 - F代入(3) [Q0] 1 1 F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5) [P0] K [P0] K [P0] 定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3) R2 + R ( 1 + K [P0] – K [Q0] ) – K [Q0] = 0 (6),3 RIA剂量反应曲线,4 方法流程 加样→温育→分离→测定→数据处理→ 签发检测报告,基本试剂 1标准抗原(Ag) 2标记抗原(*Ag) 3抗血清(抗体，Ab),1 标准抗原(Ag) 已知含量的非标记抗原 用途(1)免疫动物，制备抗体 (2)制备标记抗原 (3)作为标准品参与RIA反应，绘制剂量反应曲线 要求(1)质量上高纯度 与被测抗原属同一物质，具有 相同的免疫(生物)活性，高度纯化 (2)数量上高准确度 分一级标准(国家或国际标准) 二级标准(厂家或实验室标准) (3)稳定性好，便于贮存、运输和使用,2 抗血清(抗体，Ab) 含有抗体的血清 质量指标 (1)亲和力 (2)交叉反应率 (3)滴度,(1)亲和力 Ab与Ag的结合能力，用亲和常数K表示 Scatchard作图法得： B/F = K[Q0] – K[PQ] 为一直线 K = 直线斜率 K > 109L/mol,(2)交叉反应率 Ab与Ag类似物的结合程度，表示Ab的特异性。分别用Ag和Ag类似物（Ag#）作剂量反应曲线 Ab与 *Ag结合 被抑制50% 时[Ag]量 交叉反应率= Ab与 *Ag结合 被抑制50% 时[Ag#]量,,(3)滴度 又称效价，反映与一定量 Ag特异结合的Ab的浓度,用稀释度表示 用一定量标记Ag与不同稀 释度的Ab反应，作B%-Ab 稀释度曲线，B%=50%时对 应的Ab稀释度即为Ab滴度, 合适的滴度为1:104-106,3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度>95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月,标记Ag与Ab的用量对测定的影响 (1)待测Ag含量较高 *Ag的比活度↓ Ab的滴度↓ 灵敏度↓ 曲线范围↑ (2)待测Ag含量较低 *Ag的比活度↑ Ab的滴度↑ 灵敏度↑ 曲线范围↓,分离技术 1 非特异性 (1)吸附法 分离剂：葡聚糖凝胶包被活性炭(DCC) F被吸附沉淀，重复性差 (2)沉淀法 分离剂：聚乙二醇(PEG) B被沉淀，分离迅速， 非特异结合率高 (3)抽滤法 常用滤膜：玻璃纤维滤膜、微孔滤膜 B与F的分子量差别明显时分离效果好,2 特异性分离方法 (1)双抗体法 分离剂：第二抗体 (抗抗体， Ab2) 分离时间长，非特异结合率低 (2)双抗体+PEG法 分离迅速，非特异结合率低 (3)固相分离法 固相材料包被Ab1、Ab2 固相材料：纤维素(包被珠) 试管(包被管) 磁化颗粒,分析方法 1 反应方式 (1)平衡加样法： 标准(待测)Ag + Ab + 标记 Ag →温育→分离→ 测定 (2)顺序加样法： 标准(待测)Ag +Ab→温育 →+标记Ag→温育→分离→ 测定 提高方法灵敏度的分析方法,2 反应介质 Tris-HCl或PB缓冲液，pH7.4-7.8 离子强度0.05-0.1M 3 反应温度和时间 K大，37ْC，1-3h；K小，4 ْC，过夜 4 血样的采集与保存 (1)大都采用原样品(血清、血浆)，少数需经提取 (2)不及时分析的样品需分离出血清或血浆，-20 ْC存放 (3)采样或反应时常用抗凝剂：EDTA-Na2，防腐剂： NaN3，稳定剂：0.5% BSA、0.1%明胶、抑肽酶等,RIA反应管类型 组 类型 基本反应试剂 分离 别 名称 常用符号 Ag Ab *Ag 试剂 总放射性管 T - - √ - 标准 非特异结合管 N - - √ √ 曲线组 最大结合管 B0(S0) - √ √ √ 标准管 Si √ √ √ √ 样品组 样品管 U √ √ √ √ 质控组 质控管 QC √ √ √ √,,,,数据处理 1 B% — D 曲线 2 B% — LogD 半对数反“S”曲线 3 B/B0% — LogD 半对数反“S”曲线 4 Logit B/B0 — LogD 全对数直线 5四参数或五参数Logistic模型 曲线 6四参数单位点质量作用模型 曲线,