免疫分析法.ppt

2019/7/2,,,兴奋剂的检测方法 之免疫分析法,小组成员：鲁梦霞、熊晴、闫晓玉、潘存丽,2019/7/2,兴奋剂的检测方法 之免疫分析法,一、兴奋剂的概念 二、免疫分析法 （1）酶联免疫分析法 （2）放射免疫分析法 （3）化学发光分析法,2019/7/2,一、兴奋剂的概念,1964年，国际运动医学会的国际兴奋剂会议将兴奋剂的概念定义为: 参加竞赛的运动员使用任何异体物质，或以不正常的量和不正常的进入机体的途径使用生理物质，试图人为地以不正当方式提高其竞赛成绩的行为。,2019/7/2,,兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高效液相色谱、气相色谱－质谱联用、液相色谱－质谱联用、免疫分析法、流动注射电化学发光、高效毛细管电泳、毛细管电泳－离子阱质谱等方法。,2019/7/2,二、免疫分析法,免疫分析法是利用抗原与抗体的特异 性免疫反应来实现对禁用药物的检测的 方法。 特点：快速、高灵敏度、高特异性。 应用：主要被应用于类固醇类兴奋剂 和激素类兴奋剂的检测。,2019/7/2,,分类： （1）酶联免疫分析( enzyme－linkedimmunosorbent assay，ELISA) （2）化学发光免疫分析( chemiluminescence immunoassay，CIA) （3）放射免疫分析( radioimmunoassay，RIA),二、免疫分析法,2019/7/2,,1、酶联免疫分析法(ELISA),2019/7/2,,1、酶联免疫分析法(ELISA),2019/7/2,通过在合适的载体上酶标一定量的抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点，形成抗体复合物。在一定底物参与下，复合物上的酶催化底物使其水解氧化或还原成另一种带色物质，由于酶的降解产物与显色成正比，因此可通过酶标仪来测定，从而确定是否存在未知抗原及其含量。,酶联免疫分析法——原理,2019/7/2,酶联免疫分析法——原理,2019/7/2,,,酶联免疫分析法——特点,优点：快速 特异性强 分析容量大 安全可靠 应用：适用在现场筛选和大量样本的快速检测,2019/7/2,酶联免疫分析法——应用1,Daniel 等用酶联免疫分析法多项检测，定性、定量检测了蛋白同化激素。这个方案结合不同的交叉反应性与分布多元数据分析技术的多元竞争ELISA实验。用新型k-最近邻分类法分析了主成分。这个方案可以同时检测四种浓度范围为0.1 - 316.2nmol/L不同的类固醇，甚至在交叉反应的前提下总的检测正确率也可达90.6%。,2019/7/2,,,酶联免疫分析法——应用1,2019/7/2,酶联免疫分析法——应用2,Eva M 等将牛血清白蛋白多克隆抗体与孕三烯酮3 - 羧甲基羟胺耦合，创建了两种高灵敏度、特异的检测孕三烯酮的酶联免疫分析法。实验A，半抗原蛋白涂层条件下的检测限为0.09±0.03ng.L-1。实验B，在共轭蛋白涂层的条件下，检测限可达到0.14±0.05 ng.L-1。两个免疫测试都具有高特异性，与其他合成代谢类固醇没有任何交叉反应。一般条件下的可运用于未预处理的尿液样本中类固醇的检测，回收率可达到76~122%。,2019/7/2,酶联免疫分析法——应用2,2、放射免疫分析法(RIA),简介 1959 年美国的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)。 定义:把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种超微量物质的测定方法。,2019/7/2,,,2、放射免疫分析法(RIA),,建立在标记抗原(*Ag)和非标记抗原(Ag)对限量的特异性抗体（Ab）的竞争性结合反应。 *Ag与 Ag 具有等同的与Ab结合能力。 竞争结合反应可用下式表示： *Ag  +  Ab↔*Ag-Ab + Ag ↕ Ag-Ab,放射免疫分析法——原理,RIA反应示意图,用已知不同浓度的标准物Ag和一定量的*Ag及限量的Ab反应，随着Ag增加， *Ag与Ab结合的少， 二者变化如右图所示。游离的*Ag为F, *Ag-Ab为B。,,放射免疫分析法——原理,标准曲线,,B／(B+F)与Ag的量存在 着函数关系，绘制得标 准曲线。将未知浓度 样品按同样条件操作， 所得结合率(％)与标准 曲线相比，即可得出样 品中待测抗原的浓度。 注：T=B+F,放射免疫分析法——原理,优点： 1.灵敏度高，其最小检测值可达ng至pg水平; 2.特异性强:由于抗原抗体反应的高度特异性，该方法具有很强的特异性不需要对样品进行提纯即可直接测定; 3.重复性好、准确性佳、快速简便，免除了烦琐的化学提纯步骤； 4. 药盒种类多、标本和试剂用量少，测定方法易于规范化和自动化等。,放射免疫分析法——特点,缺点： 1.检测中有放射性污染，对操作人员有一定的辐射损害； 2.放射性废物处理上的困难和对环境有一定的污染；,放射免疫分析法——特点,甲基苯丙胺(MA)属于苯丙胺类兴奋剂，作用于中枢神经系统，具有药物依赖性及毒理学特性，是我国最为严重的滥用毒品之一。 甲基苯丙胺(MA)及其代谢物自尿排出体外，可以通过检测尿液中的苯丙胺类兴奋剂及其代谢物来认定吸毒者。通过建立甲基苯丙胺放射免疫分析法 ，采用碳化二亚胺法制备甲基苯丙胺半抗原，免疫兔使其产生相应的抗体与Na125I标记抗原组成试剂盒，检测人体体液中的甲基苯丙胺(MA)。,放射免疫分析法——应用（尿液中苯丙胺类兴奋剂的检测）,1天分8个时间段，上、下午各采四次，每组间隔45min；收集的尿液在-20℃保存待检验,,,取尿液于小离心管中，离心，取上清液供RIA分析,取50μL样品、100μL 1:600抗血清和100μL 125I-MA;37℃孵育45min，加分离剂500μL，放置15min，以3000r·min-1离心15min，抽干。,1、采样,2、样品前处理,3、检测,,4、结果,γ一记数仪记数，并自动计算尿中MA浓度(ng·ml-1),放射免疫分析法——应用,,2019/7/2,,,3、化学发光免疫分析法（CLIA）,1977年Halman将化学反应系统与免疫系统相 结合，创建了化学发光免疫测定法(CLIA )，以检测抗原或抗体。CLIA是建立放射免疫分析技术(RIA)基础上的免疫分析技术，既有免疫反应的特异性，更兼有发光反应的高敏感。,2019/7/2,,,3、化学发光免疫分析法（CLIA）,2019/7/2,,化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类,即直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法,3、化学发光免疫分析法（CLIA）,2019/7/2,,,该方法用化学发光剂直接标记抗原或抗体(化学发光剂标记物)，与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态 (沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。,化学发光免疫分析法——原理,2019/7/2,发光,Y,Y,,Y,,,磁微粒,,被测抗原,+,抗体,+,,带吖啶酯标记物抗体,,,,,,冲洗后,,,--- 夹心法,（1） 加入H2O2 （pH<10）,,,,（2） 加入碱 （pH>10）,,直接化学发光分析法——原理,2019/7/2,,,化学发光酶免疫分析法——原理,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,2019/7/2,,,化学发光酶免疫分析法——原理,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,2019/7/2,,,电化学发光免疫分析法——原理,2019/7/2,,优点：安全，灵敏度高（10-15g/ml），稳定性好，重复性较佳，结果漂移小，线性较好，准确度高，操作方便，试剂货架期长（半年~1年），浪费少，出结果快速。 缺点：仪器价格昂贵，试剂成本较高，目前有些检测项目不能用化学发光检测，待开发。,化学发光免疫分析法——特点,2019/7/2,,,化学发光免疫分析法——应用,目前，CLIA已广泛应用于生命分析、环境检测、临床检验、食品安全和工业分析等领域，rhGH兴奋剂检测试剂盒“CMZ-Assay”就是利用CLIA技术分别检测22kD-hGH和非22kD-hGH的浓度。,2019/7/2,,,世界反兴奋剂组织检测采用的是由Lasne等于2002年提出的等电聚焦( isoelectric focu-sing，IEF) 结合免疫双印迹化学发光法。 该方法基于rhEPO与内源性EPO等电点的不同从而判断被检测者是否滥用该类药物。样品经过有效富集后进行等电聚焦，之后将凝胶上的条带转移到聚偏二氟乙烯膜上进行二次印迹，二次印迹可以有效地阻止第二抗体的非特异性结合，从而避免假阳性结果的出现，最后在发光氨和过氧化氢的作用下进行化学发光检测。该方法的误检率仅为0. 006%～0. 03%。后来，针对此方法研制了特定的图像分析软件 GASepo，可进行阈值计算、条带分割和算法分类，从而达到对 EPO 定量的目的。,化学发光免疫分析法——应用,2019/7/2,参考文献,[1]李卫东.兴奋剂检测方法的研究进展[J]. 广州体育学院学报, 2012,32(3):38-43. [2]庞国芳, 等. 农药残留高通量检测技术[J]. 植物源产品, 2012, 12(1): 374. [3] Huihui Lu, Grainne Conneely, Mark A. Crowe, Margaret Aherne, Miloslav Pravda, George G.Guilbault. Screening for testosterone，methyltestosterone, 19- nortestosterone residues and their metabolites in bovine urine with enzymelinked immunosorbent assay ( ELISA) [J]. Analytica Chimica Acta, 2006, 570( 1): 116- 123. [4] Daniel Calvo, N
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