同位素分析法.ppt

同位素分析法,张玉杰 2009年,一、概念-同位素分析,单独使用同位素标记检测（技术）或与其他方法相结合或以同位素丰度比值进行药物体内外分析的方法。,第一节 概 述,二、同位素分析法的特点,精密度和灵敏度高；剂量小； 方法简便、准确性好； 提供原子、分子水平的研究手段(微观作用机理、动态变化过程) 合乎生理条件(不扰乱体内生理过程的平衡状态) 定量、定位准确； 缺点与局限（放射性同位素） 需专用的实验条件； 一定专门训练的技术人员； 实验中需要采取必要的防护措施; 同位素效应问题.,三、同位素法的基本依据,一种元素的同位素具有相同的化学性质 自然界中核素的丰度是一个确定的值 以碳元素为例，稳定同位素有12C和13C两种形式，分别占总额含量的98.893%和1.107%(共100%)。 放射性同位素具有物质性质差异的可测性,四、同位素分析法的分类,稳定同位素——稳定同位素分析法 放射性同位素——放射性同位素分析法,,六、同位素分析的主要应用领域,药代动力学研究中的应用（放射和稳定核素示踪） 制剂体内运行规律研究（靶向，定位释放） 生物样品中微量物质的分析 药物作用机理和药效评价的研究（物质代放谢的研究，物质转化的研究 ） 药物开发研究中的应用 重要性：,第二节 核物理基本知识,一 原子结构,1.原子结构 表示: AX 如：131I, 125I，18F 电子排布：2n2 原子质量数： 原子基态与激发态： 原子核的稳定性：,2.同位素、核素、同质异能素,同位素是指质子数相同而质量数（中子数）不同的原子。 1H，2H和3H；12C，13C和14C 互为同位素。,同位素,核素,原子核的质子数、中子数和原子核所处的能量 状态均相同的原子，举例： 1H，2H，12C，13C，125I,同质异能素 原子核的质子数、中子数都相同但原子核所处的能量状态不同的核素。 基态与激发态，表示方法99Tc和99mTc 99mTc与99Tc互为同质异能素,二 放射性核素及其衰变特征,放射性核素: 放射性同位素的原子核很不稳定，会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位素，这就是所谓“核衰变”。 226Ra→α,β粒子和γ射线→222Rn 稳定性核素: 稳定性同位素无放射性，物理性质稳定，以一定比例存在于自然界，对人体无害，可采取化学合成的方法将其标记到药物分中去，在生物样本中的标记药物和未标记药物的浓度可运用GC-MS或LC-MS方法同时被检测。常用的稳定同位素有2H、13C、15N和18O四种,1.放射性核素,2. 放射性核衰变:,放射性核素的原子核自发地放出射线，并转变成 新的原子核的过程； 衰变规律：原子核衰变时前后的电荷数和质量数都守恒。 举例 32-15P → 32-16S +β- 规律： MZX → M-4Z-2Y + He(α) MZX → MZ+1Y + β,3.放射性核素的特点,放射性核素在进行核衰变的时候，可放 射出α射线、 β射线、γ射线和电子俘 获等，但是放射性核素在进行核衰变的 时候并不一定能同时放射出这几种射线; 放出的射线由原子核决定的; 放射性核素具有一定的寿命。,4.半衰期,即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一半所用的时间 如：32P 的半衰期为14.3天，即原来有100万个32P原 子，经过14.3天后，只剩下50万个.,5. 放射性核衰变的类型,α衰变 β-衰变 β＋衰变（正电子衰变） 电子俘获衰变 γ衰变,(1) α衰变,不稳定原子核自发地放射出α粒子而变成另 一核素的过程称作α衰变。,,,α粒子 由2个质子和2个中子组成（氦原子核），带正电荷。 α粒子（射线）的特性： 电离和激发能力强; 穿透能力较差。,(2) β-衰变,如： 由32P到32S的衰变 32P → 32S +β- + v + Q,不稳定原子核自发地放射出β-粒子而变成另一核素的过程称作β-衰变。,β- 粒子（射线） 是高速运动的负电子流 β- 粒子的特性： 穿透力弱 电离和激发作用较强,(3) β＋衰变（正电子衰变）,由于核内中子缺乏致使放射出正电子的衰变，称为正电子衰变或β＋衰变。,如； 18 F → 18 O +β＋ + v + Q,正电子的特性: 射程只有１～2mm,主要用于医学显像诊断。,(4) 电子俘获衰变,原子核俘获一个核外轨道电子使核内一个质子转变成一个中子，发生在缺中子的原子核. 如： 125I + e → 125Te+ γ,核外电子被俘获进原子核内，外层电子向内层补充，放射出X射线 或将能量传给更外层电子使其成为自由电子（俄歇电子）,（3）电子俘获后，有时原子核还有较高能量，处于激发态，放射出γ射线而回复到基态。 （4）或把能量转给一个核外电子，使之发射出去，称为内转换电子。,电子俘获衰变核素所发射的特征Ｘ射线、γ射线可用于核素显像（如111In, 67Ga,201TI）,电子俘获衰变核素125I广泛用于体外分析中。,(5) γ衰变,激发态的原子核以放射出γ射线（光子）的形 式释放能量而跃迁到较低能量级的过程称作γ衰 变。常继发在α、β- 衰变后。 如： 99mTc的衰变 　　　99mTc　→　99Tc　＋　γ　＋Ｑ,γ射线: 是中性的光子流 γ射线的特性: 电离能力很小，穿透力最强，射程最大， 1MeV的γ射线在空气中的射程约有1米之远； γ射线作用于物质可产生光电效应、康普顿 效应和电子对效应，它不会被物质完全吸 收，只会随着物质厚度的增加而逐渐减弱。,三 射线与物质的相互作用,（一）带电粒子与物质的作用 1 电离作用 2 激发作用 3 散射作用 4 轫致辐射 5 吸收作用,,,电离作用,是指α、β等带电粒子使物质中的原子失去轨道电子而形成自由电子和正离子的过程。 入射粒子的电荷量越大，电离作用越强； 所以，α粒子的电离本领比β粒子大得多； 若脱离出来的电子的能量足够大，它又可使其他原子电离，称为次级电离； 在单位路径中形成的离子对数为电离密度，是反映电离本领的指标。,激发作用,带电粒子通过物质时，原子的电子获得能量而使其从内层轨道跳到外层轨道，这时原子从稳定状态变成激发状态，这种作用成为激发作用； 被激发的原子极不稳定，很快由激发态退回到稳定的基态同时放出X射线以释放多余的能量。,* 电离和激发作用是一些探测器工作的物质基础，是射线引起物理、化学变化和生物效应的机制之一。,散射作用,β射线由于质量 小，行进途中易受介 质原子核静电场的作 用而改变原来的运动 方向，这种现象称为 散射。一般带电粒子 在物质中通过可能经 过多次散射。,高能量快速运动的β粒子，突然被原子序数高的 物质（如铅）阻止后，急剧降低速度，电子的一部分或 全部动能转化为连续能量的X射线发射出来，这种现象叫 轫致辐射。 它发生的几率与β射线的能量和物质的原子序数成正 比，因此在防护上采用低密度材料，以减少轫致辐射。 β射线能被不太厚的铝层等吸收。,轫致辐射,吸收作用,带电粒子使物质的原子发生电离和激发的过 程中，射线的能量全部耗尽，射线不再存在称做 吸收作用。 带电粒子在物质中沿运动轨迹所经过的距 离称为射程。 带电粒子的能量损失与粒子的动能和吸收 物质的性质有关，所以射程能比较直观地 反映带电粒子贯穿本领的大小。,（二）光子与物质的相互作用,1 光电效应 2 康普顿效应 3 电子对生成,光电效应,γ光子与靶物质原子相互 作用，γ光子的全部能量转 移给原子中的束缚电子，使 这些电子从原子中发射出 来，γ光子本身消失。留下 的电子空位立即被外层电子 填充，随即发射X射线和俄 歇电子。 发射出的电子称为光电 子，光电子按β粒子同样的 方式，将其能量电离，其它 原子则消耗掉。,光电效应,康普顿效应,入射γ光子与原子的核外电子发生非弹性碰撞，光子的一部分能量转移给电子，使它反冲出来，而光子的运动方向和能量都发生都发生了变化，成为散射光子； 康普顿电子象光电效应中的情况一样，按与β粒子相同的方式消散它的能量，散射光子进一步通过光电或康普顿过程被吸收。,康普顿效应,电子对效应 ——,γ光子与靶物质原子的原子核库仑场作用，光子转化为正 - 负电子对。,电子对生成效应,第三节 放射性强度及其度量单位,1Bq=1s-1 1Ci=3.7×1010Bq 1Bq=2.7×10-11Ci 1 mCi=37 MBq 1μCi= 37 kBq,放射性强度是指单位时间内发生衰变的原子核数,单位用贝可（becquered, Bq ）表示, 为1秒钟内发生一次核衰变。,1 放射性强度(放射性活度),1kBq=103Bq 1MBq=106Bq 1GBq=109Bq,2 比放射性强度（比活度）,表示单位重量药物中含有的放射性强度(活度)。 以此表示物质中放射性核素的含量. C = A/m C: 放射性比活度,单位是Bq/g, MBq/g, MBq/mol A: 核素的放射性强度,单位是Bq m: 物质的质量,单位是g 放射性浓度 单位体积溶液中所含的放射性活度，单位是Bq/ml, Bq/L, mCi/ml。,3 放射性化学纯度（放化纯度）,供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放 射性强度占总放射性强度的百分比。 一般要求>90～95%,第四节 放射性同位素的检测,一.方法(闪烁计数法) γ计数法： 放出γ射线的同位素（125I）及其标记药物的检测（简单） 液体闪烁计数法： 用于检测低能β-射线发射体（如3H，14C及其标记药物）（复杂）,测量结果表示,计数率—射线每分钟的计数次数（cpm） Bq = cpm /E Bq 放射性强度（每分钟衰变数） cpm 计数率 E 计数效率 计数效率（探测效率）： 被探测的放射性物质所放射的总粒子或总光子与探测系统所记录的脉冲数之比称探测效率E E= 记录到探测系统的脉冲数/射向探测器源发射总粒子数×100%,二 γ计数法,（一）探测原理 其与物质作用的机制是：光电效应，康谱顿效应和生成电子对后产生次级电子—引起物质电离和激发.,γ射线 → 碘化钠（光电效应，康谱顿效应和生成电子 对）→ 次级电子 → 光子（荧光） → 光 电倍增管,三 液体闪烁计数法,1 探测原理 闪烁体溶液：由溶剂和溶质（又称闪烁体）组成。 溶剂——吸收辐射能量和溶解样品的作用 溶质（闪烁体）——从受激溶剂分子得到能量，然后发出闪光（荧光） （1）溶剂 常为芳香族化合物，如：甲苯（亲脂性放射性 药物），二氧杂环己烷（亲水性放射性药物）,（2）溶质（闪烁体）,高效 荧光 体有 机分 子,闪烁液产生光子的过程：,α，β射线 溶剂分子吸收 溶剂分子吸收hv激发 发射光子光子→闪烁体吸收hv发出光子→光电倍增管,2 样品制备,使待测样品充分溶解在闪烁体溶液中，使放射能 尽量转变为光能；排除样品中荧光淬灭物质的干扰 可使用增溶剂等，不溶物可制成乳剂等。 颜色较深者，可采用氧化脱色或氧化成无机物。,第五节 药物研究中常用的放射 性同位素及注意事项,一 药物研究常用放射性同位素,物质代谢转化研究:3H,14C,32P; 体外放射分析:125I; 临床脏器功能测定和显像:131I,99mTc,111In,1.3H（氚）,氢（1H）这种元素有两种同位素2H和3H； 在自然界中氢主要以1H的形式存在； 3H的半衰期比较长，标记药物在使用期间不用考虑放射性强弱的衰减问题 ； 放出的是能量较低的软β射线 注意问题,2.14C,自然界中碳的同位素主要是12C，13C，14C是人工制取的。 14C的标记也比较困难，但其一般成为有机化合物骨架的一部分，代谢过程中一般不会失去。,3.125I,125I有合适的半衰期; 标记物很容易制备; 放出γ射线能量高，很容易用γ测定仪测出，因 此应用非常普遍; 由于其放出的γ射线能量较高，对人体有伤害， 因此要特别注意防护。,4 99mTc,是99Tc的激发态; 它的半衰期只有6.01小时; 由99Mo-99mTc发射器获得; 发射单纯低能γ射线，能量为140KeV; 由于99mTc的化学性质非常活泼，容易标记各种化合 物，射线能量合适，产生的图像质量很高，因此被广 泛用于医学科研与临床。,二 放射性同位素使用中的注意事项,1.同位素效应 是指同位素标记药物后引起药物理化性质的变化 2.放射性的危害 　内照射 外照射,3.防护的必要性,（1）试验人员的自我防护 　　　　　3H，14C要防止内辐射 125I要防止外照射 （2）放射性去污染和放射性废物处理 废液 固体,第六节 放射性标记物的制备,一 标记方法 （一） 125I标记 I原子的化学性质活泼，可采用取代反应将其标记在药物上。 氯胺T法 碘原法（Iodogen）,,氯胺T是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯 酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。 氯胺T（或H2O2）+ 2*Iˉ→ *I2 + 2OHˉ,.氯胺T法,终止碘化反应：加入还原剂偏重亚硫酸钠, 以终止碘化反应 层析纯化:,2 碘原法（Iodogen）,原理　用Iodogen为氧化剂，对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，把125I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记后取出样品即停止反应，不使用任何还原剂。,方法 (1)标记之前，先把Iodogen溶于有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。 (2)标记时，将蛋白质溶液置于反应管中，反应管置于冰浴中。碘化时，125I与蛋白质克分子之比例为1～1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达10min，从反应管中转移出反应混合液，使其反应停止。,（二） 3H标记,非定位：气体曝射法（同位素交换法），即将 药物与氚气密封在一起，放置几天或数周， 使氚与药物分子中的1H发生交换； 氚可与药物分子中的1H发生多处交换，因此只 能得到非定位标定的药物； 定位标记：特殊合成路线，将3H引入药物结构 中的指定位置，常用的方法是对药物双键部位 催化加氚（加成）。困难,（三）14C标记,同3H标记，实验室标记也比较困难， 起始试剂为14CO2或Ba14CO3。,3 放射性标记化合物的纯化与鉴定,凝胶过滤法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P 系列。分离标记蛋白与无机碘时，通常用Sephadex G— 25或G—50，然后用G—100进一步纯化。 离子交换法一般是制成离子交换层析柱，用于分离纯化 短肽标记物。 透析法　能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。 电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。,（1）纯化标记化合物的常用方法,亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强，保持生物活性好，但操作较复杂。 高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速，但需特殊设备。 伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一种植物凝集素，对糖蛋白有良好吸附能力，因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。 然后测定标记效率和比活性。,（2）标记化合物的主要质量指标,放射化学纯度； 放射性比活度； 生物活性和免疫活性； 标记位置和定量分布情况等。,放射化学纯度及放化纯度鉴定,放射化学纯度：放射性核素标记化合物都是以一定的化学形态存在的，所以： 　　放射化学纯度（%）=特定化学形态的放射性活度/样品总放射性活度×100 放射化学纯度的测定方法： 原则是高效的化学分离与灵敏的放射性测量相结合。常用下列方法： ① 放射层析法，又称放射色谱法：本法是利用色谱技术使混合物中各组份分离，然后测定各组份的放射性活度。 ② 放射性高效液相层析法：,生物活性,①物理化学方法：可用电泳 法、吸附法及凝胶过滤法等物理化学方法来测定标记蛋白质的结构改变情况; ②特异结合试验： ③生物特性测定：,