资源描述
1,第二章 色谱分析概述,2,HP高压液相色谱仪,气相色谱仪,3,第一节 色谱法的发展,Mikhail Semyonovich Tsvet
1872-1919,他的第一篇关于色谱法的论文发表在1903年华沙的《生物学杂志》上。1906～1910年的论文都发表在德国的《植物学杂志》上。在这几篇论文中，他详细地叙述了利用自己设计的色谱分析仪器，分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。,4,把碳酸钙装在玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管内，然后加入石油醚淋洗。依靠碳酸钙对不同色素吸附能力的差别，把色素分离成一个个带有颜色的谱带，色谱一词也由此得名。,Chromatography（色谱）
＝chromatus（颜色）
＋ Graphein（记录）,5,玻璃管称为色谱柱
碳酸钙填充物称为固定相
淋洗液石油醚称为流动相,6,From Wikipedia, encyclopedia,色谱的发展,The method was described on December 30, 1901 at the 11th Congress of Naturalists and Doctors (XI съезд естествоиспытателей и врачей) in Saint Petersburg.,7,,The first printed description was in 1903, in the Proceedings of the Warsaw Society of Naturalists, section of biology.,,Tswett M., On a new category of adsorption phenomena and its application in biochemical analysis, Proc. Warsaw Soc. Nat. Sci. (Biol), 14 (1903) 6.,华沙举行的“自然科学学会生物学分会会议”,Tswett M提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。,8,He first used the term chromatography in print in 1906 in his two papers about chlorophy in the German botanical journal, Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft.,9,1931年，德籍奥地利化学家 R. Kuhn利用茨维特的方法，在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成α和β两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。,茨维特发现色谱法之后的20多年里，几乎无人问津这一技术。,10,,1938年，Kuhn因在维生素、核黄素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果被授予诺贝尔化学奖。,,,,,,Richard Kuhn，1900-1967
生于奥地利维也纳。1922年毕业于慕尼黑大学，获哲学博士学位，1926-1929年任苏黎世高等技术学校教授。1929年任凯撒.威廉医学研究所化学部主任。1950年任海德堡大学生物化学教授，1955年任普朗克研究所副所长，是国际化学联合会会员，1938年任副会长。还是海德堡科学院、纽约科学院院士，德国化学会，伦敦化学会，印度化学会，波兰化学会，日本药学与生物化学会会员。,11,12,13,Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 1902～1971,蒂塞利乌斯 1925 年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究。1930年发表了关于色谱法和吸附的论文。他因对电泳分析和吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948年诺贝尔化学奖。,电泳的创始人,重
要
发
展,Richard L. M. Synge,Archer John Porter Martin,Chem.Ind.(Lond.), 19 (1941) 487Biochemical Journal, 35 (1941) 1358.,马丁和辛格因在1941年发明了分配色谱法特别是纸上色谱分析法而共享了1952年诺贝尔化学奖。,分配色谱的创始人,15,Stanford Moore
1913--1982,William Howard Stein
1911--1980,氨基酸自动分析仪发明人,斯坦福·穆尔，利用定量分析的方法解决了有关氨基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题；由于对胰腺的核糖核酸酶的研究使酶化学得以进一步发展，荣获了一九七二年的诺贝尔化学奖。,16,1952年,1957年，Golay首先应用小口径毛细管柱进行色谱分离实验，结果证明了它具有高分辨率和高效能——即今日的高效气相色谱法。,毛细管柱的创始人,17,20世纪，60年代末，为解决生命科学、生物工程技术中高沸点、强极性、热不稳定、大分子复杂混合物的分离分析，法国的G.Aubouin和美国的Scott等人几乎同时各自发明了高效液相色谱。,18,近年来，气相色谱、高效液相色谱、薄层色谱等在化学、生物学、医药学及相邻学科领域得到广泛应用，特别是分离和分析各种复杂的混合物，解决了大量其他分析方法不能解决的分析课题。
在工业上，色谱法是自动分析和自动控制的重要技术。它还是研究物质物理化学性质、化学反应机理的有效手段。
因此，色谱是现代分离科学和分析化学中发展最快、应用最广、潜力最大的领域之一。,19,第二节 色谱法分类,一、按两相的状态分类,液体作为流动相，为液相色谱 liquid chromatography
气体作为流动相，为气相色谱 gas chromatography
超临界流体为流动相 ，为超临界色谱 SFC,固定相：色谱分析过程中不移动的具有吸附活性的固体或涂渍在载体表面的液体。,流动相：色谱分析过程中携带组分向前移动的物质。,20,液－固色谱（liquid-solid chromatography） 液－液色谱（liquid-liquid chromatography） 气－固色谱（gas-solid chromatography） 气－液色谱（gas-liquid chromatography）,21,二、按固定相的固定方式分类,22,三、按分离机理分类,,23,１、吸附色谱法,,吸附,,解吸,,,再吸附,,再解吸,,分开,分离机制：
利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。,24,,２、分配色谱法,连续萃取过程,固定相：吸附在惰性载体上的液体
流动相：必须与固定相不为互溶,分离机制：
利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离。,25,3、离子交换色谱法,阳离子交换树脂
RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+,分离机制：
依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离。,固定相：离子交换树脂
流动相：水或溶剂的缓冲溶液
被分离组分：离子型的有机物或无机物,26,4、空间排阻色谱法,分离机制：
利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。,固定相：多孔性凝胶
流动相：水——凝胶过滤色谱（HFC)
流动相：有机溶剂——凝胶渗透色谱 (GPC),27,按照制备量来分类：分析色谱和制备色谱。
按照填料的强度来分类：经典的软胶色谱和现代高效液相色谱。,其它分类方法：,28,第三节 色谱法的特点及应用,优
点,高选择性——可将性质相似的组分分开
高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果
高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析
分析速度快——几~几十分钟完成分离；一次 可以测多种样品
应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍生 化,,29,缺
点,对未知物分析的定性专属性差，需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)。,分析工作者必须根据分析的目的，选择固定相和流动相的组成以及检测器，并建立分析系统，并通过大量实验加以证实。因此，要求分析工作者必须理解色谱法的理论，并不断积累经验。,30,(1)广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；,(2)液相色谱法在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。,(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。,(4)色谱-质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。,色谱法的应用,31,与固定相作用弱的组分先流出；作用强的组分后流出。,图示,一、色谱分离的实质 P239,第四节 色谱法基本原理,32,二、色谱流出曲线,样品混合物经色谱柱分离后依次流出，通过柱后检测器时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，称为色谱流出曲线。,33,33,1、基线 ：柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中0-t线．稳定的基线应该是一条水平直线。,曲线上突起部分就是色谱峰,,基线,,34,34,,2、峰高 ：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图中。,峰高h,35,35,色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。,色谱峰区域宽度的三种表示方法：,3、区域宽度,1. 峰宽W
色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距(CD),2. 半峰宽W1/2
峰高一半处对应的峰宽,3.标准偏差σ 0.607倍峰高处色谱峰宽的一半,W = 4σ ；W1/2 = 2.354σ,36,死时间t0：,不与固定相相互作用的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间,,保留时间tR：,试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间。,,4、保留值,37,37,由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR′实际上是组份在固定相中停留的总时间。,某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间。,保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响。,（1）调整保留时间tR′,38,38,,（2）相对保留值（选择因子）γ2.1,,相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。,组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值。,39,5、色谱图参数信息,1、根据色谱峰的个数，可以判断样品组分的最少个数。,2、根据色谱峰的保留值可以进行定性分析。,3、根据色谱峰的面积和峰高可以进行定量分析。,4、根据色谱峰的保留值和峰宽是评价色谱柱分离效能的重要依据。,5、两色谱峰的距离是固定相（or流动相）选择是否合适的依据。,40,三、色谱基本理论,色谱理论需要解决的问题：
色谱分离过程的热力学和动力学问题；
影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径；
柱效与分离度的评价指标及其关系。,两种色谱理论：塔板理论和速率理论,41,分配系数（K）:指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比。,相平衡参数,K为热力学常数，与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关；实验条件固定，K仅与组分性质有关。,两组分分配系数相差越大，分离效果越好。,42,容量因子（k）：又称分配比，容量比，指组分在固定相和流动相中分配量（质量、体积、物质的量）之比。,,容量因子（k）可直接从色谱图中求出：,43,不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等,,提供了分离的可能性,各组分沿柱子扩散分布,,峰变宽，不利于组分分离,动力学因素控制；
（两相中的运动阻力，扩散）,热力学因素控制；
（组分和固定相的结构和性质）,44,12:25:23,1、塔板理论-柱分离效能指标
（plate theory）,半经验理论：
将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于精馏塔塔板上的平衡过程）。,45,试样沿色谱柱方向的纵向扩散可忽略；
将流动相看作成脉动（间歇）过程，每次进入柱子的最小体积为一个塔板的体积；
每块塔板上，组分在两相间能达到瞬时分配平衡；
每次分配的分配系数相同，与组分在塔板中的浓度无关。,(1) 塔板理论的假设,46,实验中n由峰宽和保留时间确定：,（2)理论塔板数和理论塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。
用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。,色谱柱的理论塔板数n：,n = L / H,L：色谱柱长；H：理论塔板高度,47,（3)有效塔板数和有效塔板高度,组分在t0时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数和有效塔板高度：,48,（4）塔板理论的特点和不足,当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,49,12:25:23,2、速率理论-影响柱效的因素,H：理论塔板高度
u：载气的线速度,存在着最佳流速,（1）速率方程（范.弟姆特方程式）,H = A + B/u + C·u,涡流扩散项,,分子扩散项,,传质阻力项,,减小A、B、C三项可提高柱效,50,色谱柱内的组分随流动相在固定相颗粒间运动，组分在空隙间穿行时碰到固定相颗粒，不断的改变方向，形成了“湍流”。如果固定相颗粒不均匀，组分分子各自走过的路径不同，而使谱带展宽。,A─涡流扩散项,51,12:25:23,dp：固定相的平均颗粒直径
λ：固定相的填充不均匀因子，在1～8之间。,固定相颗粒越小（dp↓），填充越均匀（λ↓），A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,52,B/u —分子扩散项,由于加入的组分在柱的轴向上形成浓度梯度，因此当组分以“塞子”形式随流动相流动的时候，分子自发的向前和向后扩散使谱带展宽。,53,12:25:23,γ：弯曲因子，填充柱色谱， γ <1。
D：组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）,分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;
扩散系数与组分性质、载气、柱温、柱压有关，D∝(M载气)-1/2 ；M载气↑。B值↓。,54,C ·u —传质阻力项,由于溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。,55,12:25:23,k为容量因子； Dg 、DL为扩散系数。,C =（Cg + CL）,气液色谱传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，即：,减小担体粒度、选择低固定液含量、选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,56,（2）载气流速与柱效——最佳流速,57,以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,H - u曲线与最佳流速：,58,（3） 速率理论的要点,组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。,通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。,各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,59,四、分离度,物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：,保留值之差──色谱过程的热力学因素；
区域宽度──色谱过程的动力学因素。,60,（1）选择性好，柱效高，分离完全。,（2）柱效较高，选择性较好，基本上完全分离。,（3）选择性好，但柱效低。,（4）选择性和柱效都很差。,色谱分离中的四种情况如图所示：,61,61,,单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标，又叫分辨率。,tR1和tR2为相邻谱带的保留时间，W1和W2为峰宽。R为谱带l和谱带2的分离度。,62,,通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。,63,63,对于复杂样品的分析，所有待测组分的分辨率要足够大，才能满足定量分析的要求，同时分离过程要尽可能短，保证痕量分析的灵敏度。这就是色谱优化理论。,,对于一个具体的色谱分离，R值应该多大？,64,令W1=W2=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），塔板数与选择性、分离度的关系：,选择因子,分离度,五、基本色谱分离方程式,65,66,n：色谱柱的理论塔板数，是柱效的度量。
增加柱长可提高柱效，但是柱长增加, 分析时间也随之增加, 峰宽也随保留时间延长而增加, 因此, 单纯追求长柱不可取，更主要的是通过提高层析柱填充剂的效能来达到。,67,：选择因子,① 值很小的变化, 可使R有较大的变化。,② 值趋近于1时, 它的改变对的增加R尤为显著；较大时, 对R的影响减少。,③ k、n、 三个参数中, 的增加对改进分离最有效。,68,68,⑴ 改变固定相使各组分的分配系数有较大差别。例如分离苯和环己烷, 以邻苯二甲酸二壬酯作固定液, 值为1.5；而以, ‘-氧二丙腈作固定液, 增加至6.3。
⑵ 改变柱温。采用较低柱温, 一般有利于增大
⑶ 改变流动相的性质和组成。
⑷ 利用化学衍生法改变组分的性质, 从而改变它们的分配系数。,改变组分的 值方法：,69,69,,容量因子k,柱长一定, 在给定操作条件下, n值一定, 此时k大, k/(1＋k)也越大, R越大。适当增大k有利于分离。过大的k(>10), 使k/(1+k)的改变不大, 对R的改进不明显, 反而使保留时间大为延长。
分离度一定, 如R = 1.5, k越大, 达到该分离度所需的n值越小, 即所需柱子越短。,70,70,在实际应用中，一般不具备条件改变n，而是通过改变淋洗剂的溶剂强度来控制分离效果，使多元复杂组分中最难分离物质对的 值最大，最后流出的物质的容量因子k最小。,71,12:25:23,例题：,r21= 100 / 85 = 1.18,在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85和100秒，要达到完全分离，即R=1.5 ，计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？,L有效 = n有效·H有效 = 1547×0.1 = 155 cm,n有效 = 16R2 [r21 / (r21 —1) ]2
= 16×1.52 ×(1.18 / 0.18 ) 2= 1547（块）,
展开阅读全文
相关搜索
