1、抗 生 素 发 酵 生 产 工艺Antibiotics Fermentation Production,鲁东大学生命科学学院,1. 概述 Introduction,抗生素是次级代谢产物中的一大类。,1）初级代谢和次级代谢的关系,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长过程呈平行关系；次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行
2、关系，一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环境条件变化而停止。,初级代谢与初级代谢的关系：,1、存在范围及产物类型不同,2、对产生者自身的重要性不同,3、同微生物生长过程的关系明显不同,4、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,(5)、相关酶的专一性不同,相对来
3、说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物，,另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是在产生菌对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶，这些酶通常因环境条件变化而不能合成。,初级代谢与初级代谢的关系：,(1)、存在范围及产物类型不同,(2)、对产生者自身的重要性不同,(3)、同微生物生长过程的关系明显不同,(4)、对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,(5)、相关酶的专一性不同,(6)
4、某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型,初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量；初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中的重要中间体物质。而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，避免初级代谢过程中某种（或某些）中间体或产物过量积累对机体产生的毒害作用。,2）次级代谢在微生物生长中的作用,富集营养,例：大肠杆菌，铁缺乏，产肠道杆菌素离子载体类抗生素：富集碱金属,入侵宿主,例：水稻叶枯菌，蛇孢菌素苏云金芽孢杆菌：核苷酸类外毒素,3）抗生素类型,根据抗生素的作用机制分类 ：抑制细胞壁合成 (Cell Wall Synthesis) ：
5、 青霉素抑制细胞膜功能 (Cell Membrane Damage) ：多烯类抗生素抑制蛋白质合成 (Protein Synthesis) ： 四环素抑制核酸合成 (Nucleic Acid Synthesis) ： 丝裂霉素,根据抗生素的化学结构分类-内酰胺类 (-lactam)： 青霉素类头孢菌素类 氨基糖苷类 (aminoglycosides) ： 链霉素、庆大霉素大环内酯类 (macrolides) ： 红霉素、麦迪加霉素四 环 类 (tetracyclines) ：四环素、土霉素多 肽 类 (polymyxin) ： 多粘菌素,3）抗生素类型,2. 抗生素代谢调控机制,1）抗生素合成
6、酶诱导,抗生素一般在微生物生长的对数期以后开始合成，酶是诱导产生的,诱导物质在微生物生长末期加入有效，在菌体生长期和抗生素合成期加入无效。,次级代谢酶的合成和微生物生长速率有关。,例：麦角碱，色氨酸或色氨酸结构类似物诱导,2）抗生素合成酶的阻遏与抑制,合成酶阻遏,初级末端代谢产物抑制,发生在转录或转译级别例：杀念珠菌素（转录，灰色链霉菌），以乙酸、丙酸为前体，合成酶催化，48h产生,3）分解代谢物阻遏,碳源阻遏,不是本身的直接抑制，由于较易利用，刺激了微生物生长例：新生霉素：柠檬酸、葡萄糖橙黄芽孢杆菌：甘油、淀粉，橙色菌素,可以采用流加技术控制碳源浓度不刺激微生物生长范围内,3）分解代谢物阻遏
7、,氮源阻遏,红霉素，受氮源抑制杀念珠菌素，豆饼水解液尽量选择较难利用的氮源例：链霉素发酵，脯氨酸作唯一氮源，大幅提高产量,黄豆饼粉较常用,4）磷酸盐调节,磷酸盐是抗生素生产菌生长限制养分,无机P浓度超过10mmol/L时，抗生素合成受到抑制,无机P促进初级代谢，抑制次级代谢,例：四环素、杀念珠菌素、万古霉素,无机P抑制刺激代谢物的诱导物（前体）的合成,麦角碱的诱导物色氨酸，二甲烯基丙基色氨酸合成酶,3. 抗生素生产工艺,1）菌种,放线菌、霉菌、细菌减少传代次数，减少变异几率液氮、真空冷冻干燥保藏基因工程育种,2）孢子制备,孢子培养基5-7d,3）种子制备,孢子发芽，繁殖获得足够数量的菌丝一级种
8、量：0.1-0.2%二级：5-20%,4）培养基,碳氮源,前体,磷酸盐,培养基质量,5）发酵,目的：大量合成抗生素接种量10%以上过程控制,6）发酵液预处理,目的：调整发酵液理化性质，除杂、除菌体无机离子：钙、镁、铁蛋白胶体：等点、加热、絮凝,7）抗生素提取及精制,时间短、温度低、合适pH、环境消毒方法：溶媒法、离子交换法,脱色去热源,结晶,4. 青霉素生产工艺（实例）,青霉素V和G临床应用,母环：缬氨酸、半胱氨酸、-氨基己二酸,1）青霉素生物合成机制,碳源调节葡萄糖分解代谢物阻遏,氮源调节铵根离子阻遏,赖氨酸调节-氨基己二酸,2）青霉素生产菌种,1929年弗莱明，点青霉 发酵单位 2U/ml
9、1943年美国，产黄青霉 发酵单位 120U/ml，产黄色素目前，发酵单位85000U/ml，绿色和黄色孢子两种菌,期初称菌丝生长期，产生青霉素较少，而菌丝浓度增加很多；期适于作发酵用种子； 期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势逐渐减弱，大量产生青霉素；在期末、期初即应放罐；期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。,3）青霉素生产工艺,工 艺 流 程 图,种子制备,按菌丝形态分为丝状菌和球状菌工厂一般采用绿色丝状菌,深度保藏：沙土管斜面（葡萄糖、甘油、蛋白胨），25，培养6-7d液体种子（培养基：葡萄糖、乳糖及玉米浆），27 ，40h，菌丝浓度40%。,种子质量控制：菌丝稠密、丝团少，菌丝粗壮、有中小空泡
10、，处于生长第-期。,碳源氮源前体无机盐,目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。,可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸子粉，并补加无机氮源。,为生物合成含有苄基的青霉素G，需在发酵中加入前体苯乙酸或苯乙酰胺。采用多次加入方式。,硫、磷、钙、镁、钾等盐类。,发酵培养基,加糖控制补氮及加前体pH控制温度控制通气和搅拌泡沫和消泡,一般在残糖将至0.6左右，pH上升时开始加糖。,加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氮源控制在0.010.05。补前体以使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.050.08。,加酸或碱自动控制pH，一般为6.46.6。,一般前期2526，后期23，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。,抗生素深层培养需要通气与搅拌。,可用天然油脂如豆油、玉米油或用化学合成消泡剂“泡敌”（环氧丙稀环氧乙烯聚醚类）来消泡。应当控制其用量并少量多次加入。,发酵控制,1. 过滤2. 提炼3. 脱色4. 共沸蒸馏或直接结晶,宜采用鼓式真空过滤器。过滤前加去乳化剂降温。,采用溶媒萃取法，醋酸丁酯（BA）作溶媒。,采用活性炭进行脱色。过滤。,提取精制,Thanks！,
