1、基于层层自组装技术的电流型免疫传感器1本科生毕业论文题 目： 基于层层自组装技术的电流型免疫传感器 学生姓名： 莫吾雏 学 号： 200812010125 专业班级： 化学 08101 班 指导教师： 张 松 柏 完成时间： 2012 年 5 月 10 日 基于层层自组装技术的电流型免疫传感器2目 录摘要 31 前言 52 实验部分 62.1 实验试剂与仪器 62.1.1 试剂 62.1.2 仪器 62.2 纳米金的制备 72.3 免疫传感器的制备 82.4 实验方法 92.5 传感器的再生 93 结果与讨论 93.1 传感器的构建 93.2 实验条件的优化 113.2.1 反应温度的影响11
2、3.2.2 pH值对抗体固定的影响 113.2.3 反应时间的影响 113.2.4 抗体浓度的影响 123.3 灵敏度检测与标准曲线 123.4 传感器的再生 134 结论 135 参考文献 136 致谢 14基于层层自组装技术的电流型免疫传感器3基于层层自组装技术的电流型免疫传感器莫吾雏化学化工学院 化学 08101 班摘要：层层自组装技术已经广泛应用于特异性生物识别分子的固定，本文就是以层层自组装(LBL)的方法利用基团与基底的特殊作用进行层层组装。先在金电极表面自组装一层己二硫醇，再通过巯基与金的作用自组装一层金纳米颗粒，在金纳米颗粒单层上面可以固定抗体，最后用 BSA 封闭抗体的非特异
3、性结合位点,从而构建可以用于检测特异性待测抗原的电流型免疫传感器。电流型免疫传感器主要通过测定在恒定电压下免疫反应引起的电流变化测定待测物的浓度，采用该方法制备的传感器灵敏度高、稳定性好、重现性能优良,传感器经适当处理还能重复使用。关键词：自组装，电化学生物传感器，免疫检测，纳米金基于层层自组装技术的电流型免疫传感器4Electrochemical Immunosensor Based on Layer-by-layer Self-assembly Technology Mo WuchuCollege of Chemistry and Chemical Engineering, Class 0
4、8102Abstract: Layer-by-layer self-assembly technology has been widely used in fixing specific biological recognition molecular. Using this technology, the proposed paper developed an electrochemical immunosenor using human IgG as the model analyte. First, a layer of hexanedithiol was assembled onto
5、the surface of the gold electrode by the strong affinity of mercapto group with Au. Then, antibodies were immobilized onto the surface of gold nanoparticles, and the non-specific sites were blocked with BSA. Then the sensor was fabricated and was used to test the target protein. The proposed biosens
6、or takes advantages of high sensitivity, good stability and excellent reproducibility. Moreover, the proposed biosensor can be easily regenerated.Keywords: self-assembly, electrochemical biosensor, immunoassay, gold nanoparticles基于层层自组装技术的电流型免疫传感器51 前言生 物 传 感 器 （ biosensor） 就 是 对 生 物 物 质 敏 感 并 将 其 浓
7、 度 转 换 为 电 信 号 进 行 检 测的 仪 器 ， 是 由 固 定 化 的 生 物 敏 感 材 料 作 识 别 元 件 （ 包 括 酶 、 抗 体 、 抗 原 、 微 生 物 、 细 胞 、组 织 、 核 酸 等 生 物 活 性 物 质 ） 与 适 当 的 理 化 换 能 器 （ 如 氧 电 极 、 光 敏 管 、 场 效 应 管 、 压电 晶 体 等 等 ） 及 信 号 放 大 装 置 构 成 的 分 析 工 具 或 系 统 。 生 物 传 感 器 根 据 生 物 传 感 器 中 分子 识 别 元 件 即 敏 感 元 件 可 分 为 五 类 ： 酶 传 感 器 （ enzymesen
8、sor） ， 微 生 物 传 感 器（ microbialsensor） ， 细 胞 传 感 器 （ organallsensor） ， 组 织 传 感 器 （ tis-suesensor） 和免 疫 传 感 器 （ immunolsensor） 。 在过去几十年中，电化学技术的发展已在免疫检测中得到广泛应用，其预处理过程简便、使用仪器廉价、灵敏度高、样品用量少、检测过程可自动完成、传感器小型化、不受样品种类干扰、检测用时短，在众多检测方法中表现出优越的性能。对任何一种电化学免疫检测方案而言，生物组分的固定是关键因素，因为生物识别物质能够恰当地固定在合适的基底上，不仅能够保证免疫物质充分的生物
9、活性，也能够影响到免疫传感器的可靠性及再生性。直接将抗体固定在固体基底表面通常会引起不必要的构型改变及抗体生物活性的损失，通常使用的固定方法将基于共价结合的免疫物质固定在经功能化后的电极表面，如聚合膜、乳液-聚合膜、溶胶-凝胶膜。生物传感器呈现良好的工作性能, 其固定化技术应满足以下条件: (1) 固定化后的生物组分仍能维持良好的生物活性；(2) 生物膜与转换器须紧密接触，且能适应多种测试环境；(3) 固定化层要有良好的稳定性和耐用性；(4) 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。然而，这些共价结合的技术通常在传感器的重现性和再生性实验中效果不佳。为克服这些困难，研究者已做出
10、大量的努力。一个较为理想的方案就是采用不同种类纳米级结构的材料，例如纳米粒子和纳米管来固定免疫反应物质。值得一提的是，纳米金颗粒由于其独特的物理和化学性质，如颗粒尺寸易控制、可长期稳定保存、与各种免疫反应物质的生物适应性强等原因，在近几年里尤为引人注目，已逐步应用到各种免疫检测技术中。另外，通过使用这些固定方法，充分提高了电极表面结合抗体和抗原的能力，从而也提高了传感器的灵敏度。基于层层自组装技术的电流型免疫传感器6本研究以人 IgG 作为目标物，提出一种基于已二硫醇、巯基乙醇和纳米金颗粒层层自组装的可再生、高灵敏度的电化学免疫传感器。电极先用已二硫醇修饰在电极表面，再用巯基乙醇对电极表未组装
11、位点进行封闭，继而可通过金-硫键之间的强结合力将纳米金单分子层组装到电极表面。之后，抗体吸附到纳米金颗粒表面并形成可与抗原结合的传感界面。传感器的再生能很容易地通过将电极浸泡在碱液中实现。实验条件经优化后，该传感器能呈现出良好的再生性和稳定性。传感器的构建及操作原理参见示意图 3.1。图 1 传感界面的制备过程和抗体抗原反应的示意图2 实验部分2.1 试剂与仪器羊抗人 IgG 抗体(IgG Ab, 亲和纯化)、人 IgG、牛血清蛋白(BSA)购于鼎国生化试剂公司。采用磷酸缓冲液(PBS)作为工作液。己二硫醇、巯基乙醇均购于长沙化学试剂公司。其余化学试剂均为分析纯，未经进一步纯化。实验过程全部采
12、用去离子水。实验中所有的电化学检测均采用 AD300 电化学工作站（天津爱达科技发展有限公司）基于层层自组装技术的电流型免疫传感器7，在室温下、自制的检测池中进行。实验使用传统的三电极体系：金电极作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，铂电极作为对电极。纳米金表征用本院 722 型分光光度计。2.2 纳米金的制备实验中所用的玻璃器具均用新配王水(体积比，硝酸: 盐酸=1:3) 浸泡，并在使用前用去离子水彻底清洗。称取 1.0g 柠檬酸三钠配用 100ml 容量瓶制成 100ml 溶液待用。取 500ml三颈瓶和冷凝管和搅拌器，将仪器组装成如图 2 所示。向三颈瓶中加入 100ml 去
13、离子水和1ml1%的 HAuCl4 搅拌加热至沸腾。再向中间加入 3ml 柠檬酸三钠，加热一段时间，溶液逐渐变红，变红后继续加热 40min，然后自然冷却。生成的红色溶液为产品。图 2 纳米金制备示意图再用可见分光光度计对生成液进行吸光度检测，在 450nm-600nm 范围内测量其吸光度。（如图 3 所示）检测结果为在 520 nm 时吸收峰最高，为 0.797，表明纳米金颗粒直径大概为 13 nm。基于层层自组装技术的电流型免疫传感器8图 3 所制备的纳米金溶液吸收光谱图2.3 免疫传感器的制备金电极在 0.3 m 的打磨纸上打磨后，用蒸馏水冲洗干净。在 0.1 M H2SO4 溶液中于-
14、0.2 至 +1.6 V 的电位范围内进行电化学循环伏安扫描，循环 15 次，。随后，于电极表面组装已二硫醇。将电极冲洗并吹干，在电极表面滴加 10L 已二硫醇，并用烧杯盖上，静置反应 1h。之后，再用巯基乙醇封闭电极表面未组装有已二硫醇的空隙。在电极表面滴加10L 巯基乙醇，并用烧杯盖上，静置反应 30min。然后，电极插入到纳米金溶液中反应过夜，以获得纳米金单分子层。最后，在电极表面滴加 10 L 抗体溶液，反应 1 h。再将 10 L 10 mg/mL BSA 溶液滴加到电极表面用以覆盖多余的非特异性位点。这样传感器制备完毕。传感器不用时可泡于蒸馏水中，冰箱里保存。传感器制备的每一步均在
15、 5 mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6中进行电化学循环伏安和交流伏安扫描以进行表征和监控。2.4 实验方法先验证实验方案是否可行。取 10L 的抗原样品滴加到传感界面，反应 1 h，在 5 mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6中于-0.2 至+0.6 的电位范围内进行交流伏安扫描。观察峰电流与之前的峰电流对比确定电流信号是否有明显变化。对传感器分析性能进行考察时，取不同浓度的 10 L 抗原样品滴加到传感界面，反应1 h。随后以同样的方法对电极进行电化学检测。基于层层自组装技术的电流型免疫传感器92.5 传感器的再生每次免疫检测完成后，传感器可以进行再生。具体做法是将金电极
16、插入到含 0.2 M NaOH 及 0.5 M NaCl 的溶液中浸泡 30 min。随后，10 L 羊抗人 IgG 抗体溶液可滴加到再生后的电极表面。抗体在纳米金颗粒表面吸附反应 1h。最后，电极用蒸馏水清洗干净，可用作下一次检测。3 结果与讨论3.1 传感器的构建电流型免疫传感器主要通过测定在恒定电压下免疫反应引起的电流变化测定待测物的浓度，而在构建传感器的过程中，可以用循环伏安法和交流伏安表征出每一步所引起的电流变化去判定传感器是否构建成功，因为对电极的每一步修饰都会使电流减小，从而表现出波峰下降。首先用循环伏安法和交流伏安法测量打磨好的裸电极，结果如下图的 a 线。然后在电极表面滴加
17、10L 已二硫醇，静置反应一个小时后用同样方法测量，结果如下图 b 线，与a 线相比较，峰高下降较明显，说明已二硫醇已经成功修饰到电极表面。再在电极表面滴加 10L 巯基乙醇，静置反应 30min，对电极表面未修饰有已二硫醇的位点进行封闭，同样再用循环伏安法和交流伏安法测量，结果如下图 c 线，与 b 线相比较，峰高也有明显下降，说明已经成功对电极表面封闭。然后将电极浸泡在纳米金溶液中过夜，取出电极后同样用循环伏安法和交流伏安法测量，结果如下图 d 线，与 c 线相比较，峰高也有明显下降，说明电极表面已经形成了纳米金单分子层。之后使抗体与纳米金结合，将羊抗人 IgG 抗体10L 滴加到电极表面
18、，静置反应一个小时，再次测量，结果如下图 e 线，与 d 线直比较，峰高有明显下降，说明抗体已经与纳米金结合。最后再用 BSA 封闭纳米金表面未结合抗体的位点，在电极表面滴加 BSA 溶液 10L，静置反应 30min，再用循环伏安法和交流伏安法测量，结果如下图 f 线，与 e 线相比较，峰高也有明显下降，说明 BSA 已与未结合抗基于层层自组装技术的电流型免疫传感器10体的纳米金封闭。图 4 传感器制备过程循环伏安和交流伏安表征3.2 实验条件的优化3.2.1 反应温度的影响免疫反应温度对传感器分析性能有直接影响。实验分别考察了 4，15，25，37，47 和57六种不同反应温度下传感器的分析性能，发现在 37下反应传感器电流变化最大，说明免疫反应在该温度下最充分。而温度继续升高时电流变化急剧下降，这可能是因为温度高于生理温度时，可能导致了抗原抗体活性下降。
