1、系 统 实 验 之 二T淋巴细胞功能测定付海英实验流程 1W1.双向免疫扩散试验 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 1. 2. (ELISA) OVA (1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔内注射500 l OVA (1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔内注射500 l OVA+CFA加强免疫小鼠500 l OVA+CFA500 l 摘眼球取血无菌取脾和胸腺分离血清2W取脾和胸腺 淋巴细胞转化试验生理盐水（500 l )免疫小鼠腹腔内注射生理盐水（500 l )免疫小鼠腹腔内注射生理盐水加强免疫小鼠500 l 500 l 2WAfter 1W对照组实验组抗体效价增殖功能实验内容小鼠摘眼球取血、分
2、离血清淋巴细胞转化试验教学要求掌握小鼠血清的分离掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作淋巴细胞转化试验(Lymphocyte transformation test)原理检测方法操作步骤应用原理Lymphocytes(B/T)MitogensSpecificity AgProliferationTransformationLymphoblastNucleicAcidProtein检测方法 形态学方法 3H-TdR掺入法 MTT法(本次实验采用)形 态 学 方 法淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细要表现有体积明显增大，是成熟淋巴胞的3-4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并倍；
3、染色质疏松，核仁 见；胞浆丰富并形成空泡。根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数，以前三者 细胞，每份标本计数200个细胞，个细胞，按下式计算转化 1 0 0 %未 转 化 的 淋 巴 细 胞 数转 化 的 淋 巴 细 胞 数转 化 的 淋 巴 细 胞 数转 化 率3H- Td R 掺 入 法G0 G1有丝 分裂原特 异性抗 原 SPr ,RNAD NA前 体物 质
4、 DNANew DNA3H-Td RTd RT R3 H-T dRcp mm值对 照 管值刺 激 管c p mc p mC o n AS IMT T 法活/增殖期的细胞线 粒体能 量代谢 琥珀酸脱氢酶MTMTM 掺入掺还还原甲甲臜臜颗粒颗粒formazn细胞内/ 周围周围溶解测A值值对 照 管值刺 激 管AAC o n AS I操作步骤1W1.双向琼脂扩散试验2.酶联免疫吸附试验（ELISA）1.2. ELISAOVA免疫/生理盐水VA /无菌取脾/胸腺研磨成单细胞悬液(1 / 2脾/胸腺+ 2 ml I M DM（无F CS )/研磨成单细悬 (1 / 2 /+ 2ml I M DM F C
5、S )摘眼取血 获取血清细胞计数【? / m l】取2 0 l细胞+ 98 0 l的计数液? / ml2 0 l细胞+ 98 0 l 计数加板(三复孔)(加法见附图)加板(三复孔)(加法见附 )调细胞浓度? / mlA=1 .511 0 7浓度?/ m l A=1 .5 1 1 073 75 %C O 2 培养4 8小时3 7 5 % C O 2 4 8小时培养终止前2小时加入M T T (5 mg / ml ) 1 0 l/ w e ll培养终止前2 加入M TT (5mg / ml ) 1 0 l/ w e ll3 75 % C O2继续培养2小时3 75 % C O222 0 0 0 r
6、p m 5 mi n2 0 0 0 rp m 5 min小心弃去上清，加入1 00 l/ 孔DM S O振荡，使颗粒全部溶解小心弃 加入1 0 0 l / DM S O振荡，使颗粒 溶解酶标仪测吸光度值：A 5 7 0 n m酶标仪测吸光度A 5 7 0n m结果判定：S I = C o n A孔A值/对照孔A值结果判定：S I = C o n A A /对照孔A淋巴细胞转化试验的应用 患者 胞免疫功能检查 细 估 疾病的 效及 后计 疗 预 胞配型抗原的 ：移植免疫细 检查 免疫 理 ：具有免疫 的 物、药 学 调节 药保健品、中草 及生物制品药 生毒理 的 究卫 学 研实验分组及材料 器材
7、1. 酒精棉球 若干2. 无菌纱布块 1块/组3. 无菌平皿 1块/组4. 无菌吸头（大、中、小）4盒/room5. 无菌96孔培养板 1块/组6. 可调微量 器 4 /room. 细胞计数板 1 /组. 微 1 /组9. EP管 若干1 . 、小 4 /room11. 细胞培养 （37 5%CO 2) 器材1. 酒精棉球 若干2. 无菌纱布块 1块/组3. 无菌平皿 1块/组4. 无菌吸头（大、中、小）4盒/room5. 无菌96孔培养板 1块/组6. 可调微量 器 4 /room. 细胞计数板 1 /组. 微 1 /组9. EP管 若干1 . 、小 4 /room11. 细胞培养 （37
8、5%CO 2)12. 酶 13. 2 /room14. 2 /room 物 试 1. 小 2/组(NS,OVA)2. 培养 （IMDM) 无FCS 100ml/room3. 培养 （IMDM)20%FCS 30ml/room4. ConA（2.5,5,10g/ml) 1.5ml/tube 5. 细胞计数 （2% 酸）2/room6. MTT（5mg/ml) 1.5ml/room. 二甲（DMSO) 5ml/组12. 酶 13. 2 /room14. 2 /room 物 试 1. 小 2/组(NS,OVA)2. 培养 （IMDM) 无FCS 100ml/room3. 培养 （IMDM)20%FC
9、S 30ml/room4. ConA（2.5,5,10g/ml) 1.5ml/tube 5. 细胞计数 （2% 酸）2/room6. MTT（5mg/ml) 1.5ml/room. 二甲（DMSO) 5ml/组分组 组currency1“ 小 currency1中“currency1“fiflcurrency1 currency1 currency1免疫血清分离过程摘眼球取血 RT for 2hrsRotation3000rpmfor 20minTransfer serum to a new EPDouble diffusionStore at 4ELISAI1.5ml EP实验步骤 细胞 的
10、小鼠 ，用 球 。2 取 和 ( 2)，分别 入 有2MMcurrency1的“ 。3 3-4fifl ，用 ，用” ， 。 用 000fifl细胞 ，入 。 细胞计数取 的细胞 取 20，有 0计数的 ， 显 下计数，计数方法见。2 细胞 0 ， 为 ，要的细胞体积为 可按 式 0 NOTE: 前“原细胞 ”currency1细胞 细胞数currency1 细胞 的小鼠 ，用 球 。2 取 和 ( 2)，分别 入 有2MMcurrency1的“ 。3 3-4fifl ，用 ，用” ， 。 用 000fifl细胞 ，入 。 细胞计数取 的细胞 取 20，有 0计数的 ， 显 下计数，计数方法见
11、。2 细胞 0 ， 为 ，要的细胞体积为 可按 式 0 NOTE: 前“原细胞 ”currency1细胞 细胞数currency1细胞计数板 个大方的 细胞数(X) 算 每个大方的细胞数 Y=X/4 每个大方的体积为V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml 的细胞的细胞 /ml)=Y 104 倍数(50)4 细胞培养按 。2 标 ， 显 下 细胞， 3 02currency1 ，currency14 小 。 MTT掺入（“ 2:00）currency1前2小 ， 显 下 细胞转化情况。2 每孔 入MTT g ) 0，完搕 ，使MTT和细胞 。3 3 02currency1 继续c
12、urrency12小 ， 离心2000rp，in，弃去清， 注意不要孔底部的颗粒物弃 ）。4 入 00二甲亚砜 MSO)，颗粒溶解。 一天下午4:00） 测结果测 用酶标仪测光密 值 0n 用空白孔 零）， 录结果。2 结果判 S 刺激指数）on 刺激孔 值 对照孔 值 细胞培养按 。2 标 ， 显 下 细胞， 3 02currency1 ，currency14 小 。 MTT掺入（“ 2:00）currency1前2小 ， 显 下 细胞转化情况。2 每孔 入MTT g ) 0，完搕 ，使MTT和细胞 。3 3 02currency1 继续currency12小 ， 离心2000rp，in，弃去清， 注意不要孔底部的颗粒物弃 ）。4 入 00二甲亚砜 MSO)，颗粒溶解。 一天下午4:00） 测结果测 用酶标仪测光密 值 0n 用空白孔 零）， 录结果。2 结果判 S 刺激指数）on 刺激孔 值 对照孔 值
