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催乳素(PRL)基因的克隆与筛选,临床生物化学与仪器学教研室
李恒,概 述,基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆、基因操作或重组DNA技术。,概 述,基因克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等
基因克隆可概括为∶分、切、接、转、筛。,质 粒,质粒（plasimid）是独立于染色体以外的能自主复制的共价、双链、闭合、环状DNA分子。主要存在于细菌、真菌、放线菌中。,质粒具有复制能力、转移性及选则标记等基本特性，携带外源基因进入细菌中扩增或表达。
质粒DNA的分离与纯化是最常用、最基本的分子生物学实验技术。,实验一 质粒DNA的分离纯化,【实验目的】,了解提取质粒的原理。
学习和掌握质粒提取的方法和技术。
——三个基本步骤：
细菌的生长和质粒的扩增
菌体的收集裂解及质粒DNA的释放
质粒DNA的分离纯化,裂解法：基于细菌染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异。,【实验原理】,【试剂与器材】,超净工作台
恒温摇床
高速离心机
量筒、三角瓶、平皿、
EP管、枪头、LB培养基
溶液I 溶液Ⅱ 溶液Ⅲ
TE(pH8.0),【实验步骤】,细菌的生长和质粒的扩增
菌体的收集裂解及质粒DNA的释放
质粒DNA的分离纯化,细菌的生长和质粒的扩增
取一环冷冻保存的菌种（含pUC19）接种于LB固体
平板（含Amp）上，倒置37℃过夜
取单个菌落，接种于3-5mlLB液体培养基（含
50g/mLAmp）中，37℃振荡过夜,菌体的收集裂解及质粒DNA的释放
取5 ml菌液于生化管中，4500rpm 5min，弃上清
用STE液加至生化管2/3处，漂洗沉淀， 4500rpm 5min
用STE液1.5ml转入EP管，12000rpm 5min
加200uL冰预冷溶液I（强烈振荡混匀完全分散菌体）
加400uL溶液Ⅱ，快速温和颠倒EP管4-6次，
冰浴5min，（溶液变黏稠）
加300uL冰预冷溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，冰浴
5min，（白色絮状沉淀）
12000rpm，5min，上清转至新EP管,质粒DNA的分离纯化
加等体积氯仿（振荡混匀），12000rpm 5min,
上层水相转至新EP管，重复一次
加1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积无水乙醇（充分
混匀），-20℃ 10min，12000rpm 10min，弃上清
加1ml预冷70%乙醇（轻弹混匀），12000rpm 5min,弃上清将EP管倒置于滤纸上，室温敞口，10-15min
加入50lTE，溶解沉淀，待用,注意事项,1.加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；
2.加溶液Ⅱ裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性；
3.加溶液Ⅲ后pH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开。
4.酚-氯仿抽提离心后，小心吸取上清，勿吸有机相。,溶液 I,50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0)
10 mmol/L EDTA (pH8.0)
在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。
作用：分散菌体，鳌合金属离子使金属失活,溶液 Ⅱ,0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)
1%SDS
作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。,溶液Ⅲ,5mol/L 乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L
作用：酸性条件下质粒DNA复性，染色体DNA不能复性沉淀，高分子RNA沉淀。钾离子与SDS、蛋白质、膜形成复合物。,实验二 核酸的浓度和纯度 测定与DNA的限制性酶切反应,【实验目的】,了解：紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度及
DNA限制性酶切反应的原理。
掌握：核酸浓度和纯度的测定及DNA限制性酶
切反应的方法和技术。,【实验原理】,紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度：
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长是260nm，在260nm波长的紫外线下，1个吸光度值相当于双链DNA浓度为50ug/mL；单
链DNA或RNA为40ug/mL。可以借此来计算核酸的浓度。
通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。,【实验原理】,DNA的限制性酶切反应：
限制性内切酶是有细菌自己产生的能识别双链DNA分子中特定碱基序列，并以内切方式水解双链核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。内切酶可以分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。 Ⅱ型酶就是基因工程常用的水解酶，能识别具有特异核苷酸序列的双链DNA，并在这个识别的特异核苷酸序列内进行切割。,【实验原理】,DNA的限制性酶切反应：
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
示意图：,【试剂与器材】,限制性内切酶EcoRⅠ及缓冲液
紫外分光光度计及石英比色皿,【实验步骤】,紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度：
1.紫外分光光度计预热20min；
2.吸取5uLDNA样品，加水至1mL混匀，转入石英比色皿；
3.在260nm和280nm，以蒸馏水调零，分别读取“A”；
4.计算：,双链DNA样品的浓度(ug/uL)=A260*稀释倍数*（50/1000）
=A260*（1000/5）*（50/1000）
=A260*10
双链DNA样品的纯度：A260/A280,【实验步骤】,DNA的限制性酶切反应：
1.取EP管,按下表依次加入下列试剂：
2.用封口膜封口，混匀，12000r/min离心2min，37℃
水浴过夜。,注意事项,1.A260/A280的比值可以反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0.若为DNA样品，比值大于1.8，说明仍有RNA，可以用RNA酶处理样品；小于1.6，说明样品中纯在蛋白质或酚，应再用酚-氯仿抽提。
2.进行酶切时，要在其最适温度下进行（多数为37℃ ）。
3.每一种酶用专用缓冲液，缓冲液加入量为总体积1/10。
4.酶切反应总体积为20uL,反应体系中，DNA模板最终量为6-8ug。,实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳,【实验目的】,了解：琼脂糖凝胶电泳的原理。
掌握：琼脂糖凝胶的制作及电泳的方法。,【实验原理】,琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖，溶解后链间的糖分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，构成大网孔型凝胶。随着琼脂糖浓度的不同形成不同孔径的凝胶，用于分离、纯化相对分子质量大小不同的DNA分子。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带有负电荷，在处于电场的琼脂糖凝胶中向正极泳动。不同的DNA分子在同一电场中的电泳速率不同，从而达到分离的目的。,【实验原理】,荧光嵌入燃料如溴化乙锭分子嵌入DNA分子中形成络合物，由于溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，从而在紫外线下直接观察DNA条带在凝胶中的位置。,【试剂与器材】,低熔点琼脂糖（约65℃熔化 ）
5×TBE电泳缓冲液
溴化乙锭（EB）
稳压稳流电泳仪
水平电泳槽及点样梳
溶液Ⅳ（加样缓冲液）,【实验步骤】,1.配制0.7%低熔点琼脂糖溶液；
2.冷却至55℃左右，加入EB（0.5ug/mL），摇动混匀；
3.用胶带围封电泳板两端，平置，插好点样梳，将温热的琼脂糖溶液倒入电泳板中，冷却后放4℃冰箱10-20min；
4.拔出梳子，撕去胶带，将电泳板放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液500mL;
5.加5uL溶液Ⅳ于DNA样品管中，混匀，取20uL混合液加入加样孔中（潜水式加样）；
6.盖上电泳槽盖，接好电源线，打开电源开关，以1-5V/cm电压电泳，
7.在紫外分析仪的玻璃平板上观察电泳结果。,注意事项,1、应在琼脂糖应完全融化后制胶，倒胶时要避免产生气泡，若有气泡要用吸管吸去；
2、EB为强诱变剂，有致癌作用；
3、加样孔容积决定最大加样量，切忌加样孔中样品过多而溢出；
4、采用低电压、长时间电泳，可以得到分辨率较好、带型整齐的电泳图谱。,实验四 DNA片段的回收与重组连接,【实验目的】,了解：DNA片段的回收与重组连接的原理。
掌握：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法及
DNA重组连接技术。,【实验原理】,DNA片段的回收：
质粒、噬菌体等经酶切后，DNA片段需要纯化。常将酶切产物电泳后，从凝胶中将合适大小的DNA片段进行回收和纯化。,【实验原理】,DNA的重组连接：
在Mg2+和ATP存在下，T4-DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。
联接反应的影响因素包括温度、时间、酶量、缓冲系统、DNA末端的性质级浓度、DNA片段的大小等。,【试剂与器材】,紫外分析仪
T4DNA连接酶,DNA片段的回收：
1.在紫外灯下，从凝胶中切下含有待回收DNA的胶条，大小片段分开放置于EP管中，65℃孵育5min，捣碎；
2.加入300uL TE液，摇匀；
3.用DNA分离纯化的方法沉淀DNA。
DNA的重组连接：
1.10uL的反应体系中依次加入：目的DNA(小片段)3uL;载体（大片段）1uL;蒸馏水4uL；10×Buffer 1uL； T4DNA连接酶 1uL
2.用封口膜封口，混匀，12000r/min离心2min，16℃反应过夜。,【实验步骤】,注意事项,1.紫外灯下切下待回收DNA的凝胶时，应尽量减小含目的DNA片段胶块的体积，切割时间不超过30S；
2.紫外灯下切下待回收DNA凝胶时，防止外源DNA的污染；
3.为保证目的DNA片段装载到载体上，最好目的DNA片段的分子数/载体分子数﹥3；
4.连接酶的最佳反应温度是16℃。,质粒DNA的分离纯化
加等体积氯仿（振荡混匀），12000rpm 5min,
上层水相转至新EP管，重复一次
加1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积无水乙醇（充分
混匀），-20℃ 10min，12000rpm 10min，弃上清
加1ml预冷70%乙醇（轻弹混匀），12000rpm 5min,弃上清将EP管倒置于滤纸上，室温敞口，10-15min
加入10l蒸馏水，溶解沉淀，待用,实验五 感受态细胞 的制备（CaCl2）与转化,【实验原理】,CaCl2法制备感受态细胞的原理是：细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，待转化DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在营养丰富的培养基上生长数小时后，受体细菌分裂增殖，被转化到细菌细胞中的重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上，可筛选出所需的阳性转化子。,【试剂与器材】,DH5α菌
0.1mol/L CaCl2溶液
含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂培养平板
往复式恒温摇床,【实验步骤】,受体菌的培养
感受态细胞的制备（CaCl2法）
质粒DNA的转化,受体菌的培养
取一环冷冻保存的菌种（DH5α）接种于不含抗生素的琼脂糖平板上，倒置37℃培养过夜
取单个菌落，接种于LB液体培养
基中，37℃振荡过夜,感受态细胞的制备（CaCl2法）
取4mL菌液于5mL生化管中，冰浴10min，
4℃下4000rpm离心10min，弃上清，吸去残留液体
加1.5mL冰预冷0.1mol/L CaCl2溶液，
轻轻混悬细胞后转入Ep管中，冰浴10min，
4℃下4000rpm离心10min，弃上清，吸去残留液体
加200uL冰预冷0.1mol/L CaCl2溶液，混匀，
冰浴10min，此细胞即为感受态细胞,质粒DNA的转化
取上述感受态细胞，加入重组质粒DNA溶液，
轻轻混匀，冰浴30min
放入42℃水浴中，准确计时90s（不要摇动Ep管），
然后迅速将Ep管冰浴2min
加入200uL LB液体培养基，
于恒温摇床（37℃）培养45min
混匀菌液，用无菌棉拭子将菌液涂布于
LB固体培养基（含Amp），倒置平皿，37℃培养过夜,注意事项,1.42℃热激是一个关键步骤，准确的热激温度和时间非常重要；
2.低温对Ca2+介导DNA的转化是必须的，氯化钙处理时一定要在低温下进行；
3.防止杂菌污染，在超净工作台转种转化后细菌。,实验六 重组质粒的筛选,【实验原理】,抗性标志筛选：大多数克隆载体都带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素抗性基因、抗四环素抗性基因、抗卡那霉素抗性基因等。当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。但是，在琼脂平板上的带有抗性基因的细胞，需要进一步鉴定是否含有重组DNA或空载体。,【实验原理】,抗性标志插入失活筛选：常被用于筛选质粒重组体与非重组体。一般情况下，选用含有两个以上的抗性基因载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，用两个含有不同药物的平板互相对照，筛选含重组DNA的菌落。
双抗对照，插入失活，阴性选择。,【实验原理】,,载体
4800bp,目的基因,,,【分析讨论】,,,在含氨苄青霉素或四环素的培养基中不能够生长的细菌不含载体或重组DNA;
在含氨苄青霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长的细菌是被重组DNA转化的；
在含氨苄青霉素或四环素的培养基中都能生长的细菌只含有空载体；
根据菌落的不同抗药性可以筛选出含重组DNA的菌落。,谢谢大家！,DH5α菌 back,DH5α是最常用的生物工程菌株之一，特别是在克隆应用方面，是克隆转化专用的感受态大肠杆菌，该菌株经过特殊方法处理而获得而获得高活性感受态细胞。,
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