免疫学技术20141016盐析.ppt

免疫学技术免疫球蛋白的提取,上海交通大学医学院免疫学与微生物学系 2014年10月16日,免疫球蛋白（Immunoglobulin）,IgG是免疫球蛋白的主要成分之一 分子量约为15万~16万 沉降系数约为7s IgG是动物和人体血浆的重要成分之一,（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法,蛋白质的盐析 等电点沉淀法 低温有机溶剂沉淀法,（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法,透析与超滤 凝胶过滤法,（三）根据蛋白质带电性质进行分离,离子交换层析法 电泳法,（四）根据配体特异性的分离方法,亲和层析法,Prof. Olof Hammarsten (1841~1932),盐析法是1878年瑞士Prof. Olof Hammarsten首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。,盐 析,盐溶 ( salting in ):蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶” 盐析 ( salting out ):而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”,原理,利用蛋白质的胶体性质，在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐类（如(NH4)2SO4、Na2SO4等），使蛋白质脱水及降低颗粒表面电势，溶解度随之降低，使蛋白质从溶液中析出，此即称为盐析作用。不同浓度的中性盐可分别将不同蛋白质组分析出，达到分离之目的。,常用的中性盐,硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 优点: 温度系数变化较小 溶解度大 在水中化学性质稳定； 价廉易得 分段盐析效果好 性质温和,不易引起蛋白质变性 缺点： NH4+,用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即为该蛋白盐析的饱和度。 饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。   1．饱和硫酸铵溶液法 在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量： 式中：V0——蛋白质溶液的原始体积； C2——所要达到硫酸铵饱和度； C1——原来溶液的硫酸铵饱和度； V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。,2. 固体硫酸铵法 所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。 欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量： X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。,不同的硫酸铵浓度可分离提取不同的蛋白 蛋白质 PI g/100ml血浆 占血浆总蛋白质的百分率 盐析时硫酸铵的浓度 纤维蛋白 0.3 4 20 优球蛋白 7.7 0.2 3 33 拟优球蛋白I 5.6 1.3 17 40 拟优球蛋白II 4.1 0.5 7 46 白蛋白 4.7 5.2 69 62/70,操作步骤： 1ml血清+1ml  PBS (0.01mol/L，PH7.0 )，混匀 ↓ 边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液 2ml于溶液中，使溶液的最终饱和度为50% ↓ 4℃ 静置30min，使之充分盐析 ↓ 3000r/min离心10min，弃去上清液，（清蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白 ） ↓ 沉淀再溶于2ml PBS (0.01mol/L，PH7.0 )中 ↓ 边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液 1 ml ，使溶液的饱和度达33% ↓ 4℃ 静置30min ↓ 3000r/min离心15min，球蛋白在上清液中，沉淀为IgG。 弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀。  ↓ 将获得的粗IgG沉淀溶于1.5-2 ml PBS中,装入透析袋中，对PBS透析,注意事项,盐析时注意需将饱和硫酸铵逐滴加入稀释血清内，并迅速摇匀，防止饱和硫酸铵1次性加入或搅拌不均匀造成局部过饱和的现象，使盐析达不到预期的饱和度，得不到目的蛋白质。 搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性 注意区别前后两次盐析所加的饱和硫酸铵含量。,影响盐析的因素有：,盐的饱和度 pH值：pI 蛋白质浓度：2.5%~3.0% 温度,蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。 用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。,脱盐,（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法,蛋白质的盐析 等电点沉淀法 低温有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。,（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法,蛋白质的盐析 等电点沉淀法 低温有机溶剂沉淀法,低温有机溶剂沉淀法,用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二： 1、与盐溶液一样具有脱水作用； 2、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。,（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法,透析与超滤 凝胶过滤法,透析与超滤,透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。,（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法,透析与超滤 凝胶过滤法,凝胶过滤法,也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 最常用的填充材料是葡聚糖凝胶（Sephadex ）、聚丙烯酰胺凝胶（Sephacryl）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。,凝胶的选择,根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。 市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。,凝胶的预处理,称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。 为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。,装柱,层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。,加样与洗脱,样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。 洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。,洗脱液的收集与检测,凝胶柱的重复使用与保存,保存方法有三种： 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。,注意事项,刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。 在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。 上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的10%～25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%～5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生特异性吸附。,凝胶过滤的各种条件：根据具体的实验要求来选择 凝胶类型 层析柱大小 洗脱液 上样量 洗脱速度…,例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶过滤要有较高的分辨率 提高分辨率的选择应主要包括： 选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶 选择颗粒小的凝胶 选择分辨率高的凝胶类型 选择较长、直径较大的层析柱 减少加样量 降低洗脱速度,（三）根据蛋白质带电性质进行分离,离子交换层析法 电泳法,离子交换层析法,蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。,（三）根据蛋白质带电性质进行分离,离子交换层析法 电泳法,电泳法,各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。 等电聚焦电泳 利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。,（四）根据配体特异性的分离方法,亲和层析法,亲和层析法,是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。,