1、转录调控多组学在农学中的应用 表观组学和全转录组的结合,2017.4. 17,Outline,表观遗传全转录组（mRNA和非编码RNA）转录调控多组学,转录层面 DNA甲基化、组蛋白乙酰化、转录因子调控等,转录后层面 ncRNA(lncRNA/circRNA/sRNA)对mRNA的调控,中心法则,表观遗传,经典表观遗传学研究内容,在没有发生细胞核DNA序列改变的情况时，基因表达和调控发生了可遗传的变异。这些改变包括DNA的修饰(如DNA甲基化修饰)、组蛋白的各种修饰（如甲基化、乙酰化修饰）等。,DNA甲基化 BS-seq,组蛋白乙酰化 ChIP-seq,蜂群分化,同株不同花色,生长发育 组织分
2、化,杂种优势,近年来，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育等，起着至关重要的作用。,RNA：是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。, RNA的作用及调控机制,01 RNA研究概论,1 | mRNA,2 | lncRNA,lncRNA：是（long non-coding RNAs）是一类长度大于200nt但不编码蛋白质的RNAs，广泛存在于动植物中。它们曾长期被误认为是遗传暗物质，但近些年研究证实这类RNAs在生物的生命活动过程中起着重要的调控作用。,长度在
3、 200-100,000 nt没有编码蛋白质潜能具有细胞或组织类型特异性表达量和保守性略低于 mRNA,lincRNA、alncRNA、ilncRNAelncRNAbilncRNA,2 | lncRNA,01/ lncRNA作用形式,trans作用：调控位置相距较远的mRNA,cis作用：调控相邻位置的mRNA,2 | lncRNA,02/ lncRNA的功能,3 | miRNA,01/ miRNA的基本概念和功能,长度21-25 nt没有编码蛋白质潜能pre-miRNA具有茎环结构Dicer酶作用生成成熟miRNA降解mRNA或抑制其表达,4 | circRNA,01/ circRNA的基本
4、特征和成环机制,内含子反义互补序列配对外显子跳跃剪切人工过表达,circRNA：是一类特殊的RNA，广泛存在与动物和植物中的。特殊的环状结构使其能够逃逸RNA酶的降解，很好的体内稳定性。,4 | circRNA,02/ circRNA的表达特性和生物功能,海绵效应-竞争性结合miRNA结合蛋白质形成复合物-调控转录结合核糖体-诱导circRNA开环表达,表达的组织特异性时序性保守性,ceRNA，竞争性内源RNA, 并不是种新的RNA分， 只是种新发现的基因表达调节机制。能够竞争性结合miRNA的RNA分子互为ceRNAs。,RNA seq常规分析思路,对照组，处理组（野生与突变/常温与低温）,
5、以mRNA为研究对象,基因表达水平分析和差异基因筛选,功能富集分析，如具有的生物学功能或参与的代谢通路或信号转导途径,只研究mRNA是否太表浅？mRNA表达水平发生变化的调控机制是什么？lncRNA、circRNA、sRNA.可变剪切、转录因子、DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化文章如何提升一个高度？,问题,转录调控多组学,延伸,DNA甲基化研究方法及分析内容IP类研究方法及分析内容全转录组研究方法及分内容,1. 全基因组甲基化原理介绍,重亚硫酸氢盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经扩增目的的片段，此时尿嘧啶(U)全部转化成胸腺嘧啶
6、(T)，最后对PCR产物进行测序就可判断位点是否发生甲基化。,重亚硫酸盐,2. 样品制备及检测,DNA送样量,基因组1.5G 3g,3. 建库流程,增加质量控制步骤，提高mC位点的可信度,增加DMS与DMP分析，并对图形结果升级,增加新的功能数据库,4. 分析流程,5. 部分结果展示,甲基化水平检测,差异甲基化比较分析DMR,DMP：TSS上游2kb, ： ( 1) Methy level0.2；(2) q-value小于等于0.05；,差异甲基化比较分析DMP,DMR相关基因的GO、KEGG和InterPro富集分析,差异甲基化基因功能富集,1. 样品制备,Input是什么不经过IP过程单独
7、测序合并分析,片段多大合适200-500bp太长：覆盖不到，定位不准确太短：接头污染，数据浪费,2. 分析流程,鉴定与蛋白结合的DNA区域样本间差异结合的DNA区域差异DNA区域所在的基因功能分析,3. 关键分析内容,1. 样品制备及检测标准,RIN值含义RNA完整性RNA降解程度,smallRNA 文库,2. 文库构建,circRNA文库构建,lncRNA 文库,边合成边测序可逆阻断技术，激光荧光基团，捕获激发光,Hiseq,lncRNA：12G，PE150；,miRNA：10M以上，SE50,circRNA：8G, PE150,3.测序策略,Raw data,参考序列比对分析,基因表达水平
8、分析,GO富集分析,KEGG富集分析,相关性分析,基因差异表达分析,蛋白互作网络分析,转录因子分析,新转录本预测,可变剪切分析,SNP和InDel分析,DESeqDEGseq,GATK2,Cufflinks,rMATs,4.RNA seq数据分析,Reads 比对情况统计,SNP和InDel分析,可变剪切分析,lncRNA筛选结果统计,lncRNA特征分布,lncRNA靶基因预测,不同类型转录本整体表达水平分析,不同实验条件下转录本整体表达水平分析,不同样本间转录本整体表达水平分析,差异表达转录本火山图,差异表达转录本聚类图,差异表达转录本染色体分布图,差异表达转录本维恩图,GO富集分析,KE
9、GG富集分析,PPI,lncRNA-seq,5.lncRNA分析流程,6. miRNA分析流程,7.circRNA分析流程,差异circRNA聚类分析,circRNA来源基因分析,miRNA,lncRNA,mRNA网络分析 mRNA+miRNAmRNA+lncRNAmiRNA+lncRNAlncRNA+sRNA+mRNAcircRNA+sRNA+mRNA,8.全转录组关联分析流程,miRNA+lncRNA,miRNA可以结合lncRNA，影响lncRNA功能发挥lncRNA也可吸附miRNA，影响miRNA功能,lncRNA+miRNA+mRNA,寻找拥有相同miRNA结合位点的lncRNA-
10、mRNA pairs构建以lncRNA为decoy、miRNA为核心、mRNA为靶标的lncRNAmiRNA-mRNA pairs,circRNA+miRNA+mRNA,构建以circRNA为decoy、miRNA为核心、mRNA为靶标的circRNA-miRNA-gene pairs,组蛋白修饰和DNA甲基化调控基因表达,DMR相关基因与峰相关基因,转录组差异基因,overlap gene,9.表观组学与转录组学关联分析,文献解析-1 lncRNA+mRNA,Genome-wide screening and functional analysis identify a large numb
11、er of long noncoding RNAs involved in the sexual reproduction of rice,大量lncRNA和mRNA在配子体（尤其是花药）中特异表达,过表达lncRNA靶mRNA上调,Reversible switching between epigenetic states in honeybee behavioral subcastes.,【取样】蜂王、工蜂：5 pool X 8 brains；逆转的护理蜂、采食蜂：6 pool X 6 brains【技术】WGBS&RNA-seq【结果】（1）蜜蜂社会分工转换的过程中伴随者大量的DNA甲基
12、化；（2）DMR相关基因通过改变染色质结构或调控转录来影响整体的基因表达模式；（3）DNA甲基化既与基因的差异表达相关，也与基因的可变剪切相关。,文献解析-2 WGBS+RNA-seq,Genome-wide analyasis of DNA methylation and gene expression change in two arabidopsis ecotypes and their reciprocal hybrids,【取样】拟南芥亲代Ler、C24/正反交子代F1c、Fc1【技术】 WGBS&RNA-seq&sRNA【结果】杂交后代sRNA数量升高，通过RdDM途径引起子代甲基化区域比例的上调，从而导致部分编码区基因表达量发生变化，进一步通过功能富集筛选优势群体，形成杂种优势。,文献解析-3 WGBS+sRNA+RNAseq,
