1、基因工程原理和基本操作技术 中国医科大学 病原生物学教研室 王桂珍,2013研究生基因工程教学进度实习课 （基础二楼 病原实验室）,第一部分 绪 论 一、 基因工程发展简史 二、基因工程技术在医学上的应用 第二部分 基因工程基本理论 一、获取目的基因 二、载体 三、限制性核酸内切酶 四、DNA重组(连接)和基因转移 五、克隆株的筛选与鉴定 六、克隆基因的表达 七、真核细胞基因表达载体及表达系统 八、 核酸分子杂交技术 九、多聚酶链反应技术 十、蛋白免疫印迹杂交技术,第一部分授课重点,1.基因工程诞生的实验技术基础是什么？2.基因工程在医学中的应用范畴。3. 基因诊断常用的方法有哪些？4 何谓基
2、因治疗？基因疗法可用于哪些疾病的治疗？5 反义核酸；基因工程疫苗。,基因工程（genetic engineering） 或称重组DNA技术（recombinant DNA technique） 是指采用分子生物学方法分离具有遗传信息的DNA片段，经过在试管中的剪切、使之与适宜的载体DNA连接，建成DNA重组体，将其转入特定的宿主细胞进行复制和传代，并使外来基因获得高效表达。这种有目的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程。,基因工程具有跨物种性 , 无性扩增, 分子水平操作，细胞水平表达的特性。,（一）基因工程的诞生的理论基础和试验基础,一、基因工程发展
3、简史,遗传物质的确定1869年，瑞士Miescher米歇尔发现核酸（医学博士）1944年，美国 Avery埃弗里首次用 实验证明遗传物质就是DNA.DNA双螺旋结构的阐明1953年，美国沃森(J. D. Watson)和克里克(F. H. C. Crick)阐明了 DNA分子的双螺旋结构和碱基互补配对的原则。遗传信息传递及遗传密码的破译1958年， Crick提出遗传信息传递的中心法则。1961年，法国莫诺（Monod）与雅可布（Jacob）提出操纵子学说，开创了基因调控研究。）1965年，美国的尼伦伯格（Nirenberg）等破译遗传密码,1.理论基础,基因工程的工具酶的发现 DNA连接酶的
4、发现（1967 ） 限制性核酸内切酶(1970) DNA 转化技术的突破 （1928年英国医生Griffith发现细菌转化现象),1970年Mandel发现氯化钙处理的E.coli能转化噬菌体DNA,1972年Cohen发现氯化钙处理的E.coli能转化质粒。,基因工程载体 美国学者Lederberg 从事细菌遗传学方面的研究. 于1952年提出“质粒”(plasmid)一词 并相继发现R质粒和CoL质粒等。这些工作为基因工程载体系统的构建打下基础,Hind ,2.基因工程诞生的实验技术基础,到1972年，这三大技术都已经建立,博耶(Herbert boyer)美国加州大学 创立了DNA分子的
5、酶切和连接技术（1972）。,科恩(Stanley Cohen) 任职于美国斯坦福大学，主攻课题-细菌抗药性。 1971年底，发现了质粒DNA的转化现象，建立了质粒DNA转化技术。,（二）基因工程的诞生和发展 1、开始时期（19731976年）,1972年11月在美国夏威夷的檀香山召开有关细菌质粒研究的国际研讨会Cohen向boyer建议两个实验室联起手来进行重组DNA的实验。1973年春-DNA重组实验成功。同年11月论文发表; “重组DNA技术”的专利,1973年基因工程诞生的元年,1978年，人胰岛素基因1979年，人生长激素基因1980年，人干扰素基因,2. 发展时期 （ 197719
6、81年）1977年 人生长激素释放抑制素基因获表达（美国） 工程菌产生的第一个有应用价值的产物 。标志着生物工程制药的开始 。,在大肠杆菌中获得表达,这三项成果表明，用基因工程菌生产人体蛋白质等药物大有前途。,3. 应用时期 （1982年以后）,1982年 是基因工程从分子生物学实验室步入商品市场 并发展成为新兴产业的一年。 英国、美国、荷兰和联邦德国等开始正式批淮用基因工程菌生产的人胰岛素投放市场。,基因工程技术在医学中的应用得到迅速发展,同年我国基因工程研究取得重大成果：HBV adr型基因；人工合成的脑啡肽基因；人白细胞干扰素基因在大肠杆菌成功地实现了表达。,美国基因泰克 genente
7、ch公司1976年创建。创始人 H. Boyer与R. A.Swanson斯万森。世界上第一个基因工程胰岛素于上市。,二、基因工程在医学中的应用,（一）疾病的诊断、治疗和预防 疾病的诊断：基因诊断 基因工程抗原诊断制剂 疾病治疗： 基因工程药物 基因工程抗体 基因治疗 疾病预防： 基因工程疫苗-亚单位疫苗、核酸疫苗等（二）医学基础研究,探讨基因结构和表达 探讨抗体产生的遗传基础 探讨疾病发生机制： 探讨发育和分化之迷 探讨人体衰老之迷,基因诊断常用方法（1）多聚酶链反应(PCR)；（2）核酸杂交技术-如Southern印迹 法 （3）限制性片段长度多态性分析,1. 疾病的诊断 基因诊断或称分子
8、诊断 基因工程抗原诊断制剂,（一）疾病的诊断与防治,1）基因诊断,用分子生物学方法检测患者体内遗传物质(基因)的存在与水平、分析基因的类型或结构变化以辅助临床诊断的技术称为基因诊断。,用基因诊断方法诊断的疾病：,淋病奈瑟菌DNA多态性基因分型,2）基因工程抗原 诊断制剂,遗传性疾病 - 110 余种人类遗传性疾病 可做基 因诊断 感染性疾病-直接检测病原微生物的 遗传物质 肿瘤- 检测标志物 如P53,将编码某种抗原的基因与适当载体DNA连接，构建成DNA重组体，导入受体细胞中使之表达，从工程菌种提取、纯化出的 蛋白即可做为诊断抗原-此即基因工程抗原或疫苗。,梅毒螺旋体、HCV、人巨细胞病毒；
9、麻疹病毒、HIV等基因工程抗原诊断试剂均有研究报道。,2.疾病治疗 包括： 基因工程药物、 基因工程抗体、基因治疗 1）基因工程药物 （蛋白质和多肽类活性物质）,产品名称 治疗功能与医药范围 1、 人胰岛素 治疗糖尿病 2、 人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3、 干扰素 治疗癌症、病毒感染 4、 干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5、干扰素 治疗癌症、病毒感染 6、 人组织纤溶酶原激活因子(tPA) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7、 红细胞生成素 (Epo) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素 8. 超氧化物歧化酶 治疗关节炎，缓解心肌坏死 9、 凝血因子 治疗A型血友病 10、神经生
10、长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化,11、脑啡肤 - 镇痛作用 12、降钙素 - 治疗骨质疏松症 13、碱性成纤维细胞生长因子- 治疗进行性肌萎缩、膀胱子宫瘘等 14、人生长激素释放抑制素 - 治疗肢端肥大症和胰腺炎。,碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF ）在胚胎发育、组织愈合、周围神经再生中起重要作用。 1975年Gospodarowicz首先报道从牛的脑垂体中分离纯化（昂贵） 80年代，获得bFGF的氨基酸序列。 90年代，基因工程方法成功获得重组bFGF（231元/ug）,人生长激素释放抑制素常规的方法需要十万只羊的下丘脑才能获得1毫克，用基因工程的方法生产同等数量的人生长激素释放抑
11、制素，只需要10公升大肠杆菌培养液。,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,2）基因工程抗体 将编码抗体的基因片断与其它基因嵌合后，直接插入合适的载体并转入宿主细胞,通过基因表达,从而产生高特异性又能被机体接受的抗体。 嵌合抗体（chimeric antibaody） 双特异性抗体(bispecific antibody)或双功能抗体(bifunction antibody,BfAb) Fab抗体,Fab,人源化区70%,嵌合抗体克服了鼠源性单克隆抗体的免疫原性，逃避人体免疫系统的识别，减少超敏反应性疾病的发生。,30%鼠源性,嵌合抗体,嵌合抗IgE人源化单抗治疗哮喘病已进入期试验。,双特异性抗
12、体 （调理作用）,杀伤性T细胞,肿瘤细胞,抗前列腺癌抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达中华医学杂志2003,83（15）,双特异性抗体指一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同抗原表位的抗体。,抗人卵巢癌抗人CD3双特异性抗体中国科学院遗传与发育生物学研究所申请号/专利号： 01118247 申请日：2001-05-23,3）基因治疗(gene therapy)： 狭义基因治疗：指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。现代基因治疗：是指通过导入某些具有治疗作用的基因到患者体内，使其在体内表达，通过基因校正、基因置换或基因增强与基因失活，最终达到
13、治疗某种疾病的目的。,* 目前基因疗法已用于以下疾病的治疗研究： 遗传性疾病；肿瘤；感染性疾病；心脑血管疾病,遗传性疾病治疗：第一例基因治疗患者1990年，美国的一个4岁的小女孩患遗传性的严重复合免疫缺损症（腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏）,美国国立卫生研究院利用逆转录病毒载体，采用体外基因治疗法，经治疗4个月后康复。,1998年底，世界已有373 个临床法案被实施。3134人接受了基因转移实验。基因缺陷遗传病、肿瘤、AIDS等100多个基因治疗临床试验方案处于临床试验阶段。,感染性疾病,修饰CD4分子基因,HIV感染基因治疗,导入人T淋巴细胞,CXCR4,CD4分子表达后滞留在细胞的内质网中,细
14、胞膜表面辅受体缺乏HIV便不能进入细胞,与新合成的辅受体结合,“今又生”(深圳市赛百诺基因技术有限公司研制) 是世界首个惟一获准上市的基因治疗药物。 由正常人肿瘤抑制基因p53 和改构的5型腺病毒基因（载体） 重组而成。将重组重组腺病毒-p53 导入靶细胞内，具有广谱、特异性杀伤肿瘤细胞作用,肿瘤的基因治疗,【用法用量】在放射治疗前72小时开始瘤内注射。每周一次，每次1*1012VP（3380元），四周为一个疗程,心血管疾病基因治疗,家族性高胆固醇血症： 将人低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因导入体外培养的肝细胞，再将肝细胞回输到动物体内，可使血浆胆固醇水平显著下降 。,预防血栓形成： 将人组
15、织纤溶酶原激活物（t-PA）基因导入内皮细胞， 并将其覆于内支架表面，局部的t-PA可减少支架血栓形成率,心肌梗死和促进侧支循环：将血管内皮生长因子（VEGF）基因转移缺血动脉壁中，可促进侧支循环形成。,高血压：候选基因较多 用抗血管紧张素原（AGT）基因 ；激肽释放酶基因-参与血压调控 抗血管紧张素受体亚型-1（AT-1）mRNA的反义寡核苷酸,基因治疗的策略： 基因修正和基因置换 即将缺陷基因的异常序列进行修正。通过同源重组即基因打靶技术将外源正常基因在特定部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。, 基因失活：将特定的反义核酸（反义RNA、反义DNA和核酶）导入细胞，在转录和翻译水平
16、抑制或阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。,基因增强 不去除异常基因，而是通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。,是指能与特定mRNA或双链DNA 的正义链精确互补、 特异阻断其翻译、转录的RNA或DNA分子。,核酶-是指具有酶催化活性的RNA,反义RNA-是指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段,反义核酸,反义DNA-是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子,抑制mRNA的翻译,抑制基因DNA的转录,特异切割RNAA分子，阻断基因（有害基因）表达,反义核酸包括：反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes),阻断、调整基因的表达
17、,反义核酸在治疗慢性粒细胞白血病、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、胃癌癌中取得一定疗效。,高技术通讯 1995年12期 乙肝病毒反义DNA的合成陈常庆 陈波 徐金旺 吴祥甫 何丽芳 袁正宏 闻玉梅,免疫基因治疗：将能增强免疫效应细胞抗肿瘤效应的基因（如细胞因子(cytokine)基因或免疫共刺激分子基因）导入机体细胞，以增强免疫效应细胞的抗肿瘤能力。,自杀基因”（suicide gene therapy）疗法: 是指将某些病毒或细菌的某种酶基因导入靶细胞中，该基因表达的产物可以将无毒的药物前体转化为毒性药物，从而影响细胞DNA的合成，引起该细胞的死亡。如目前常用的自杀基因系统有tk-GCV
18、系统、CD-5-FC系统等 。可用于治疗肿瘤和感染性疾病的基因治疗。 耐药基因治疗: 耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1。,基因治疗-转基因途径体外途径和体内途径,3. 疾病预防,第一代病毒疫苗 用受染动物组织制备（ 40年代以前） 第二代 受染组织培养细胞(4060年代 ) 第三代新型疫苗 （70年代） 基因工程疫苗-亚单位疫苗、核酸疫苗等。,优点：可解决传统技术难以制备的疫苗（病原培养困难） HBV疫苗、HCV、 HIV 疫苗等； 排除病原的诱发致癌或免疫病理
19、作用（如HIV）； 纯化抗原提高免疫效应（如痢疾疫苗）； 可用于制备多价疫苗或联合疫苗.,1)基因工程疫苗,是利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。,已有研究报道的如HBsAg基因工程疫苗、百日咳疫苗;痢疾疫苗 ； SARS疫苗;疟疾疫苗；猪囊虫疫苗等,2)核酸疫苗（DNA疫苗） 1990年美国Wisconsin大学的Wolff等首次报道核酸疫苗。 核酸疫苗是由编码某种抗原的基因和表达载体构成DNA重组体，将其直接注入体内,被宿主细胞摄取后，可以表达其编码的蛋白抗原。,核酸疫苗具有许多突出的优点：能表达天然蛋白抗原可诱导细胞免疫和体液免疫生产简便、成本低廉、稳定性好且贮存方便使用安
20、全，没有感染病原的危险免疫具有持续性,能否与人体基因重组-安全性？,(二)、医学基础研究,1.探索人类遗传信息的奥秘- 基因结构和表达研究 *人类基因组结构与功能研究 人类基因组的工作草图绘制完成（2000年6月26日 ） *病原体基因组结构与功能研究微生物基因组的测序：基因组学与应用生物学中国基因组计划:测序1万个微生物，2009年04期 。自1995年国际上第一个细菌流感嗜血杆菌全基因组测定完成后，根据NCBI数据库的最新统计显示,已完成测序的5725中生物中，病毒类2248种,细菌类1262种。,2.探讨疾病发生机制： BRCA1基因突变与妇女患乳腺癌的关系BRCA1是与乳腺癌发生相关的
21、抑癌基因，参与多种重要的细胞功能活动。遗传性乳腺癌患者多数携带有BRCA1突变，突变位点因种族和地域的不同存在着差异 。 携带该突变基因的妇女患乳腺癌机率比没携带该突变基因的妇女高65%-80%。,军医进修学院学报 CAS 2010年第9期 913-915页,918页 女性乳腺癌危险因素BRCA1基因突变的观察【国际肿瘤学杂志 】 2006年1期 BRCA1与乳腺癌相关的基础和临床研究任婕综述 魏敏杰 金万宝审校,3.抗体产生的遗传基础 180亿种抗体（108） 人类基因组基因数目105（10万个基因）。,基因的重排构成了抗体的多样性,总计284,北京大学医学部衰老分子机理研究室童坦君教授等研
22、究认为,基因是人类可分裂细胞中控制衰老进程的主导基因。,1995年，C. Nusslein-Volhard、E. Wiesehaus、E. BLewis因研究果蝇的发育基因取得重大成果而荣获诺贝尔奖。胚胎发育是一个不同基因先后被激活的链式反应，即级联反应。细胞基因组严格按时空顺序相继活化，这一现象称为基因的差异表达或顺序表达。,(5) 揭示衰老之迷：,4.探讨发育和分化之迷 图,?,附：在工业农业生产方面 应用基因工程技术改良物种特性。,蓝玫瑰,如 转基因食品 从1986年 首批转基因植物被批准进入田间试验目前全球转基因作物种植面积最大的四个国家分别是美国（3,570 万公顷）、阿根廷（1,1
23、80万公顷） 、加拿大（320）和中国（150万公顷）这四个主要国家种植了全世界 99% 的转基因作物.,2002年全球转基因作物种植面积5,867 万公顷,来源 八个所谓“转基因的安全性事例” 中国农科院生物技术研究所 据初步统计，关于转基因作物的研究论文2000年676篇，2009年增加为1301篇， 十年总论文量为10171篇 。,http:/ 2010年02月08日15:58 瞭望,转基因动物,曾溢涛（中国工程院院士、上海医学遗传研究所所长）等研究获得5头能表达人凝血因子9基因的转基因羊,上海市农委孙雷主任调研转基因羊 2010-07-15 上海杰隆生物工程有限公司“人乳铁蛋白转基因山
24、羊的安全评价”“抗搔痒症转基因羊新品种的培育”,英首育转基因鸡 专下“抗癌”蛋2007年1月15日 - 英国爱丁堡罗斯林研究所的科学家们培育出了第一代转基因鸡，这种鸡所产的鸡蛋中含有可以治疗癌症和其他疾病的药用蛋白,这是在日本诞生的克隆牛，此是继“多利”羊后，科学家利用成年动物体细胞成功克隆的又一动物。,美国得克萨斯农业和机械大学的科研人员于2001年9月成功地克隆了5只猪。,1997年英国苏格兰爱丁堡罗斯林研究所利用绵羊的乳腺细胞的细胞核成功地克隆了一小羊“多利(Dolly)”。,世界上第一只克隆猴“泰特拉”在美国俄勒冈灵长类动物中心诞生,茜茜的供体,茜茜和她的代孕妈妈,2002年2月21日
25、nature报道美国得克萨斯农业和机械大学兽医学院成功地克隆出了小猫“茜茜”,基因工程引發的倫理問題,展望2l世纪是基因组医学的时代；随着基因功能、基因调控、疾病基因、基因诊断和基因治疗研究的深入，使人类对疾病的认识将产生质的飞跃，由组织器官水平、细胞水平到分子水平。并逐步形成以基因和蛋白质等大分子为核心的分子医学新体系。基因工程技术是基础,其应用必将进一步促进医学各领域的发展.,DNA重组技术的创立所获得的丰硕成果已经把人们带进了一个不可思议的梦幻般的科学世界，使人类获得了打开生命奥秘和防病治病“魔盒”的金钥匙。,第二部分重点（一）,1.基因克隆技术的基本操作程序 2.目的基因获取方法3 .
26、载体的种类，载体应具备的条件 （克隆载体、表达载体、穿梭载体、柯氏质粒 （ cosmid） 5. 限制性内切酶及其特点 酶切反应条件、切口类型6.T4DNA连接酶作用机理7.受体细胞种类8. 转化与转染9.克隆株筛选鉴定方法,第二部分基因工程技术的基本原理,基因工程技术 或称重组DNA技术recombinant DNA technology,克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的复制品。,基因克隆(gene cloning )： 是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制、扩增的技术（也包括目的基因的无细胞扩增-PCR） 。,基因表达(gen
27、e expression)： 是基因的转录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到蛋白质的传递和实现。,基因工程基本步骤 分-分离离目的DNA ；载体DNA 接- DNA体外重组技术 （ DNA酶切实验、DNA连接实验） 转-重组DNA转入受体细胞 （转化、转染试验） 筛-重组克隆的筛选与鉴定,重组克隆的筛选与鉴定： 重组体的表型筛选; 核酸鉴定： DNA酶切图谱法、 PCR方法、探针杂交法 目的基因表达产物的筛选与鉴定（免疫化学法Western印杂交， 微细胞法(microcell method),基因克隆流程图,一。 “工程原料”的获取 获取目的基因 （或称靶基因）： 是指已被或欲被分离、改造、
28、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。,获取目的基因 有三个途径,直接从基因组提取从生物基因组文库获取（鸟枪法）化学合成酶促合成,基因组文库 （gene library） 其是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段并克隆到某种载体上形成的集合。,1.直接从基因组提取 适用于目的基因序列已清楚, 且基因片段较大的原核细胞DNA。2。从生物基因组文库获取（鸟枪法）： 基因遗传背景不清时 取基因组DNA 构建基因文库 检测鉴定出目的基因。,基因文库构建,3.化学合成： 依照某一蛋白质的氨基酸序列（推算）或基因序列进行化学合成。,4.酶促合成,PCR法：用于结构清
29、楚、分子量较小的原核细胞基因. 反向转录法：真核细胞基因含有内子，提取 mRNA逆转录 cDNA 也可构建cDNA文库 分离目的基因,用于结构清楚、分子量较小的基因。简便易行，价格贵。,cDNA complementary DNA 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,二、载体 载体(Vector)是能在宿主细胞之间转移DNA片段，并能自我复制的DNA分子。在基因工程中其是目的基因的运载工具。,载体应具备下列基本条件： (1) 有复制起点，能自我复制； (2)对某一种限制酶只有一个切点； （克隆位点） (3)必须有一种选择性遗传标记；,载体的种类,按来源分：,质粒
30、载体(plasmid vector),柯氏质粒载体(cosmid vector)、,病毒载体(virus vector ).,按作用：克隆载体 表达载体 穿梭载体shuttle vector按宿主细胞： 原核细胞载体 真核细胞载体,1. 质粒载体(plasmid vector),质粒是细菌染色体以外的遗传物质，双股环状的DNA 分子, 携带遗传信息 ,在宿主细胞内能独立自主复制。,质粒载体均是由人工构建的质粒如pBR322 ,pUC19,人工构建的质粒具备以下特点： (1)自主复制，松弛型 (2)分子量较小 (3)具有数个或一个单一的酶切点 (4)具有一个以上的选择标志。,Ampr,LacZ,
31、ori,2. 噬菌体载体噬菌体（bacteriaphage）:侵袭细菌、真菌、放线菌及螺旋体的病毒。常用入噬菌体载体 野生型入噬菌体DNA长度约为48.5kb(分子量3.2107)，在病毒颗粒中为双链线形分子，具有12bp的粘性末端(cohesive end 称为COS位点) ，进入大肠杆菌之后立即互补成环。,噬菌体的溶原周期和溶菌周期,转染效率高 : 可在体外包装， 产生有感染性的噬菌体颗粒 2)筛选程序简便 : 一定长度的噬菌体DNA才能包装. 3）克隆容量大：7-23kb。 现改建的载体类型有：,入噬菌体作为克隆载体有以下优点：,插入型载体如gt11（43.7kb）-可插入7.2kb的D
32、NA片段 。 替换型载体EMBL3、EMBL4 。,嗜菌斑 （plaque）,单链丝状噬菌体包括 M13噬菌体、f1噬菌体和fd噬菌体均为单链闭环DNA分子，基因组6.4kb。彼此有很高的同源性。,M13噬菌体,M13噬菌体（+SSDNA）,在宿主细胞内ds DNA,感染宿主细胞,宿主酶系统,双链DNA复制型,噬菌体增殖,子代噬菌体释放到菌体外,生活周期既不溶菌也不溶源。,优点：用 M13噬菌体系载体克隆外源基因，可方便获得大量单链DNA分子。 应用：DNA测序（双脱氧链终止法）；制备DNA探针；寡核苷酸定点诱变。,组装成子代单链噬菌体,3. 柯氏质粒或称粘尾质粒(cosmid) 是由入噬菌体
33、DNA粘性末端（c o s区）与质粒重组而构成杂种质粒cosmid的特点: (1)有噬菌体的特征：可体外包装成噬菌体颗粒，高效转导对入噬菌体敏感的大肠杆菌。 (2)具有质粒载体特征：有质粒的复制子及抗生素抗性标志及单一限制酶切位点，在宿主细胞能象质粒DNA一样进行复制，并可用氯霉素进行扩增。 (3)具有高容量的克隆能力：自身大小约4-6Kb，可容纳插入45Kb的外源基因片段。 (4)转导时由于非重组体cosmid很小，不能在体外包装,因此利于重组克隆的筛选。,适用于构建真核细胞的基因文库。,4病毒载体 常用的病毒载体大体上可分为两大类： 整合型（integrated）载体 游离型(transi
34、ent)或称病毒颗粒型载体,整合型（integrated）载体 即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是pSV系列。,游离型(transient)或称病毒颗粒型载体 这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒载体、腺病毒载体，逆转录病毒载体及感染昆虫的杆状病毒载体等。,5克隆载体(cloning vector),4.3kb,分子量小，都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
35、,用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。,常用载体pUC18 、 pUC 19、pBR322质粒。,pBR322,6表达载体(expression vector) 在克隆载体的基本骨架上（ ori, Ampr等）增加表达元件（启动子、核糖体结合位点（RBS）、终止子等），使目的基因在寄主细胞中得以表达的载体,表达载体分类：,以表达形式分： 非融合型表达载体-直接转录并翻译出目的基因ORF对应的氨基酸 序列，即表达出完整的目的蛋白，如pKK223-3 融合型表达载体-目的基因以融合蛋白的形式表达如pGEX载体。,以受体细胞分： 原核细胞表达载体-如pGEX 载体系列 真核细胞表达载体-pCDN
36、A3.1 病毒载体等,大肠杆菌pKK322表达载体,分泌型表达载体,表达的蛋白可分泌到细胞外或细胞周质中优点：防止胞内内蛋白酶降解；使表达蛋白正确折叠。,pEZZ18载体,原核载体常用的信号肽：碱性磷酸酶信号肽（phoA）和蛋白A信号肽。真核载体常用的信号肽： a因子；酸性磷酸酶（pho5）； 常用载体：pPICZa，pGAPZa,非分泌型表达载体- pGEX系列载体,7穿梭载体(shuttle vector) 又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内（原核细胞和真核细胞）复制和往来穿梭的载体.如大肠杆菌/酵母菌穿梭载体 pYAC4 质粒图,功能:即能在
37、原核细胞中扩增,也能在真核细胞中复制。应用:主要用于在原核细胞与真核细胞之间进行基因转移.,结构特点:细菌质粒的复制原点真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS）,通常是先在原核细胞中克隆鉴定（便于重组子筛选鉴定）再转移到真核细胞中扩增或表达（可提高外源基因的表达效率和保持基因产物的天然性）,上述基因工程载体的3个重要特点： （一）都能独立自主的复制 （二）有便利的检测标志 （三）都能容易进入宿主细胞中去， 也易从宿主细胞中分离纯化出来。,不同载体的克隆容量,限制酶是进行DNA分子切割的特殊工具酶。因此，它有基因工程的 “分子剪刀”或“分子手术刀”之称。 1、概念：限制性核酸
38、内切酶(restriction endonuclease ) 是指能专一地识别DNA分子上特定的碱基序列并将DNA切断的内切酶。,三、限制性核酸内切酶,2.命名原则： 以限制酶来源的微生物学名进行命名 微生物属名(genus)+种名(species)+株或型(strain)+发现顺序,用罗马字母表示。,淀粉液化,3、分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为I、II、III型。 I、 III型酶都同时具有对DNA的修饰作用和需要ATP的限制性切割活性，对重组DNA技术无重要价值.,II型限制酶特点 分子量小； 仅需Mg2+作为辅助因子； 有严格的识别、切割顺序 。,I
39、I型限制性核酸内切酶 限制与修饰基因产物独立起作用，能识别和切割双链DNA的特异顺序,4、识别序列的特点 (I)专一性；(2)常由46个碱基组成； (3)识别的顺序具有回文结构(palindromic sequence) 即反向重复序列。5- GAA GGATCC ATC- 3 3 - CTT CCTAGG TAG-5,BamH1酶：,限制性核酸内切酶,缓冲液配置,ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口,磷酸二酯键,氢键,5,3,5.切口类型：(1)形成粘末端(cohesive end或sticky end)： 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，
40、这样的切口叫黏性末端。,A.产生5端突出的粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割，产生5端突出的粘性末端。 5-G GATCC-3- BamH I 5-G + pGATCC-3 3-CCTAG G-5- 3-CCTAGp + G-5 (5端突出的粘性末端),B.产生3端突出的粘性末端 于对称轴的3末端切割，产生3端突出的粘性末端。例如： SacI 5GAGCT C 3 SacI 5GAGCT pC-3 3C TCGAG5 3-Cp TCGAG-5 （2）形成平末端；在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割，形成平末端.如： 5A G C T 3 Alu I 5-A
41、G +pCT-3 3T C G A 5 3-TCp GA-5,6.酶切反应条件：,高浓度的DNA 会使溶液的粘待度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA,（2）合适的酶量,（1）需要合适的底物,不能含有RNA和蛋白质; 过高浓度的EDTA（乙二胺基四乙酸钠）。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS等有机试剂。,浓度适宜,底物-DNA要纯,酶和底物比例210u/ug DNA,避免使用过高的酶浓度,（3）合适的反应介质（缓冲体系）： Tris-Hcl缓冲液； PH值多在7.48.0之间；反应需要Mg+激活；,多数限制酶反应还需要 2巯基乙醇（BME） 或二硫基苏糖醇（
42、DTT） Nacl,不同的酶对Nacl的需要,（4）温度和作用时间等： 大多数限制酶的反应温度为37，个别酶则需要50、60或65的高温。 一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA用15单位的酶，保温12小时。,四、 DNA重组(连接)和基因转移 （一）DNA重组（DNA recombination） 不同的DNA片段之间的连接需要另一种工具酶-连接酶(糨糊或 “分子缝合针”作用）。 目的DNA酶切片断载体DNA酶切片断 T4DNA ligase DNA重组体.,EcoR,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来,Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶但Ecoli DNA连接酶只能“缝合”黏性末端不能“缝合”平末端；而T4 DNA连接酶既能“缝合”黏性末端又能“缝合”平末端,
