《医学免疫学与免疫学技术》-IgG抗体的提取及鉴定.ppt

《医学免疫学与免疫学技术实验》,贵阳医学院免疫学教研室,主要实验室规则,按时进实验室，不允许迟到早退 爱护实验室的仪器设备 穿白大衣入实验室，着装整齐，女生束发 禁止在实验室内嬉戏、吃食物、饮水等 实验结束后，认真清洗实验器材、打扫实验室卫生 离开实验室前请洗手,人血清IgG的提取及鉴定,2015年05月,人血清IgG的提取及鉴定,离子交换层析法提取人IgG 血清IgG鉴定,离子交换层析的基本原理,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。,离子交换层析的基本过程,带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。,离子交换剂,在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。 纤维素－O－CH2－COO-－Na＋ 基质 电荷基团 反离子,阴离子交换剂,二乙氨乙基纤维素，弱碱性,DEAE-纤维素（阴离子交换纤维素）在 pH8.6以下分离中性或酸性物质。,人IgG的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理,人IgG特性: 血清含量：9.5-12.5 mg/ml ；血清中的IgG属于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均属酸性蛋白（pI:4-5 ）。 DEAE-纤维素提取IgG原理： 在pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白被DEAE-纤维素吸附， IgG不被吸附而最早从柱中流出，而得以纯化。,血清IgG的鉴定,双向琼脂扩散实验原理： 可溶性Ag和Ab分别在琼脂凝胶内扩散。相应的Ag和Ab相遇后，在比例合适时可形成白色沉淀线。,血清IgG的鉴定,对流免疫电泳原理： 蛋白质为两性电解质，当环境pH值高于蛋白质等电点，其分子的羧基电离而带负电，处于直流电场中时，蛋白质抗原分子将从负极向正极泳动。抗体虽属蛋白质，但其等电点较高，在缓冲液中解离较少，分子量较大，移动较慢等原因使抗体反而由正极向负极泳动。 在电场中相应抗原与抗体定向对流，比例恰当处出现肉眼可见的白色沉淀线。,对流免疫电泳示意图,血清IgG的鉴定,免疫电泳原理：（immune electrophoresis） 先将抗原加到琼脂板的小孔内进行电泳，将样品中不同分子量和不同电荷的组分分离成若干区带；然后分离的各抗原成分与电泳方向平行槽中含相应抗体的免疫血清在琼脂中作双向免疫扩散。各区带蛋白在相应位置与抗体形成弧形沉淀线。 根据沉淀弧的位置、数量和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。,,人血清IgG的提取及鉴定,离子交换层析法提取人IgG流程： DEAE-纤维素预处理、采集样品（血清） 装柱、平衡 上样和洗脱 DEAE-纤维素再生 人血清IgG鉴定 ： 洗脱液抗原性鉴定—琼脂双扩散、对流免疫电泳 纯度鉴定—免疫电泳 回收率的测定—分光光度法,实验步骤,1、DEAE-纤维素预处理： 强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） 强酸处理 0.5N HCl 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） 强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） PH7.4 0.01M PB液浸泡抽滤、浸泡 2、装柱、平衡固定层析柱 装 柱：柱高度、无分层、无气泡 3、样本（人血清）准备 抽静脉血分离血清透析（PH7.4 0.01M PB液 4度过夜） 4、研磨蔗糖备用（纯化IgG浓缩用）,实验步骤,5、上样、洗脱、收集洗脱液 上样 流速3ml/10min（记录上样总体积，保留部分血清） 洗脱 流速30-40ml/cm2/h 收集 5ml/管 （20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测）6、DEAE-纤维素再生 2M NaCl 洗脱其他血清蛋白 拆柱、 浸泡 PH7.4 0.01M PB液,7、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法）,实验步骤,8、洗脱液抗原性鉴定（对流免疫电泳法）,制板 打孔 抗原加于负极端孔，抗体加于正极端孔。 置电泳槽（电压110v），45分钟左右观察结果。,,,,,Ag,,,,,Ab,Ag,Ab,,,,实验步骤,9、合并含IgG的洗脱液，通过蔗糖包埋法进行浓缩。 10、通过分光光度法对浓缩后的IgG进行回收率的测定。 11、通过免疫电泳检测所获IgG的纯度。,,,,,,,,,人血清,提纯物,兔抗人血清,,双扩散,电泳,,+,-,12、免疫电泳检测结果观察。,