半抗原与蛋白质偶联技术.ppt

半抗原与蛋白质偶联技术,,目录 抗原与半抗原 偶联蛋白 人工抗原合成的方法 影响人工抗原质量的因素 人工抗原的质量评定,抗原与半抗原,抗原,抗原 ——能与淋巴细胞抗原受体（TCR/BCR）特异性结合，刺激机体产生特异性免疫应答，并与相应免疫应答产物（指抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合反应的物质。,抗原的分类 天然抗原 如：细菌、病毒、真菌、寄生虫等。 人工抗原 如：人工结合抗原、人工合成抗原、 基因工程抗原,常见的天然抗原-细菌,,链球菌,痢疾杆菌,霍乱弧菌,伤寒杆菌,常见的天然抗原-病毒,狂犬病病毒,腺病毒,口蹄疫病毒,流感病毒,常见的其他天然抗原,真菌,,白色念珠菌 (1,000X oil),疟原虫,常见的其他天然抗原,异种动物血清 异嗜性抗原 血型抗原 主要组织相容性抗原 肿瘤抗原 　超抗原,人工抗原,人工结合抗原 ——将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联，或将无免疫原性的有机分子与蛋白质载体结合，形成载体-半抗原结合物，均属人工结合抗原。,人工抗原,人工合成抗原 ——用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。（应用这种人工合成多肽可研究氨基酸种类、序列与蛋白质抗原性及免疫原性的关系。）,人工抗原,基因工程抗原 ——通过基因重组、再表达制备的抗原物质。 如：目的基因（编码抗原）+ 载体（质粒等） 重组DNA  细胞（真核或原核） 表达  纯化  基因工程疫苗,抗原的性质,1.免疫原性： 抗原刺激机体产生特异性免疫应答，诱生相应抗体和效应淋巴细胞的能力。 2.抗原性: 抗原可在体内、外与相应的抗体/效应淋巴细胞发生特异性结合，产生免疫应答的特性。,抗原（按照免疫原性及免疫反应性）分类,1、完全抗原 : 既有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋白质分子。 2、半抗原:又称不完全抗原，单独存在时只具有抗原性而无免疫原性的物质，如二硝基酚、青霉素。,完全抗原,半抗原与载体结合后可使其具有免疫原性。 半抗原+载体 完全抗原,,半抗原,,,+,,载体,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗体,完全抗原,,,常见的偶联蛋白,常见的偶联蛋白,常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有： 牛血清白蛋白(BSA)、 卵清蛋白(OA)、 钥孔血蓝蛋白(KLH)、 人血清白蛋白(HSA) 人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。,常见的偶联蛋白,牛血清白蛋白（BSA） 包含583个氨基酸残基， 分子量为66.43kDa， 等电点为4.7。,BSA结构,常见的偶联蛋白,卵清蛋ovalbvmin 是一种糖蛋白。含有微量的磷。 是卵清中蛋白质的主要成分，约占65％。 鸡的卵清蛋白分子量约45kDa。,a.牛血清白蛋白 b.磷酸酪氨酸血清白蛋白 c.卵清蛋白 d.磷酸酪氨酸卵清蛋白,常见的偶联蛋白,钥孔血蓝蛋白(KLH) 　　　由于KLH质量大，复杂性高，与其他载体蛋白相比KLH会引起更强的免疫应答。 　　　来源于软体动物，它在系统发生上远离哺乳动物物种，在测定过程中产生会与典型靶点样品发生交叉反应的抗体的可能性较小。,常见的偶联蛋白,人血清白蛋白（简称HSA），是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。在血浆中其浓度为42g/L，约占血浆总蛋白的60%。,常见的偶联蛋白,ε-多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能的微生物类食品防腐剂。它是由25～30赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品的保鲜。,偶联蛋白的性质,载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提； 其次，载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子； 载体还应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能； 而且载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。,人工抗原合成方法,人工抗原合成方法,小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。 一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。,半抗原上的活性基团,人工抗原合成方法,1、分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 A、混合酸酐法 。 B、碳化二亚胺法。 C、N-羟琥珀酰亚胺酯法,混合酸酐法交联原理,混合酸酐法交联原理,碳化二亚胺法交联原理,碳化二亚胺法交联原理,碳化二亚胺法交联原理,人工抗原合成方法,2、含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及pH6.0～8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。 2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。,戊二醛法合成人工抗原的原理,盐酸克伦特罗重氮化反应原理,人工抗原合成方法,3、含羟基半抗原的偶联 1）琥珀酸酐法； 2）羰基二咪唑法。,人工抗原合成方法,4、含巯基半抗原的偶联 1)马来酰亚胺法。 2) 将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。,影响人工抗原质量 的因素,影响人工抗原质量的因素,偶联比 过去人们认为，联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。但实验证明，过多的半抗原并不能得到预期的结果，这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时，可能不利于载体与淋巴细胞表面结合，不能使载体引起免疫反应。 研究发现各种载体的分子量不论是否接近，最佳结合比都不尽相同，并建议为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。,影响人工抗原质量的因素,偶联桥 　　　有研究者认为，一定长度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所产生抗体专一性的增强．但也有一些研究者发现，手臂结构对免疫检测经常有不利的影响，有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强，对待测小分子亲和力却很弱，因此造成对特异性抗体检测的干扰。 可以采取两种方法来避免因偶联桥而造成的不足：一是半抗原上相同位点结合蛋白质，但免疫原和包被抗原用不同的偶联桥；二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥，但与不同半抗原位点结合。最好的偶联桥是3～6个直链的碳原子结构。,影响人工抗原质量的因素,半抗原的分子空间结构 　　　用来作半抗原的分子最好有分支结构，直链分子难以产生抗体。此外，有些抗生素或农药有多个可供蛋白质偶联的位点，但据研究报道，不同位点与蛋白质结合制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别，这可能是因为不同位点结合导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因。因此，如果一个分子内有多个不同的结合位点时，最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后，通过比较，筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。,半抗原的分子空间结构,半抗原的分子空间结构,半抗原的分子空间结构,人工抗原的质量评定,人工抗原的质量评定,合成成功鉴定 　　　鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则可初步证明人工抗原合成成功。,紫外分光光度法测定人工抗原偶联质量,人工抗原的质量评定,浓度测定 　　　人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）。因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量（mg/ml）是一致的。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。,人工抗原的质量评定,纯度鉴定 利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有未偶联的物质。,利用电泳技术鉴定人工抗原偶联的纯度,人工抗原的质量评定,偶联比的测定 分光光度法 　　　如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm，则与蛋白质肽的吸收发生重叠)，则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数，计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数,偶联比例的计算（以ＣＬＢ-ＯＶＡ为例）,人工抗原的质量评定,（同位素）标记抗原示踪法 　　　在制备半抗原-蛋白质结合物时，向反应液中同时加入一定量的标记半抗原，反应完成后，未结合的半抗原经透析除去，测定透析前后的放射性强度，就可以计算出结合百分比。再依反应时加入的蛋白质摩尔数即可知半抗原结合到蛋白质上的分子数。,