资源描述
实验三
补体参与的反应
T细胞数量及其功能检测,,Part I 补体参与的反应
补体的溶血反应
Part II T细胞数量及其功能检测
E花环形成试验－－数量测定
淋巴细胞转化试验：
形态学方法
3H—TDR掺入法
MTT比色法,功能,Part I 补体参与的反应,复习,1.补体的溶血反应,原理
绵羊红细胞（SRBC ）作为抗原与其相应抗体（溶血素）结合后，通过经典途径激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。
材料
1．抗原：2%绵羊红细胞；
2．抗体(溶血素)；
3．补体：健康豚鼠新鲜血清
4．生理盐水、24孔板等。,步骤,1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、将24孔板放在37℃温箱内15-30min，观察并记录结果。,结果:,Part II T细胞数量及其功能检测,2.E花环形成试验,原理
人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体－E受体（CD2分子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有的表面标志。,检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况 。,材料
肝素抗凝血、绵羊红细胞(SRBC)
淋巴细胞分层液、Hank’s液、1640培养液、0.5％戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液
试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等,步骤： （动作轻柔；分清滴管及枪头！！！）,⑴取肝素抗凝血与等量Hank’s液稀释混匀血3ml，用滴管贴管壁（倾斜30°）轻轻叠加于3ml分离液上（界面要清晰）→→→ 配平后1800rpm离心13mins。,1.淋巴细胞悬液的制备：,人淋巴细胞比重：1.070
淋巴细胞分层液：1.077
人红细胞比重：1.092,⑵ 另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液的试管→→→2000rpm离心5mins。
(3)弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml，重复离心两次。
2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液（约0.1ml）与绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合（分清枪头）→→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。,＊离心时要配平,3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可）,室温静置2-3mins
4. 吸去100-150ul上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置5mins。
5. 取一滴（25ul）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。,6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。,正常参考值：EtRFC：64.4±6.7％；
EaRFC：23.6±3.5％；
EsRFC：3.3±2.6％,结果,,,SRBC,淋巴细胞转化试验 －－,原理
T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。
三种方法
形态学方法、 3H-TdR掺入法、 MTT比色法,根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。
成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；
过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁；
淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1－2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；
其他细胞：中性粒细胞在培养72消失后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。,形态学方法：〔镜下观察〕
－－－淋巴细胞转化试验,淋巴细胞转化率：,正常参考值：80％,红细胞,未转化淋巴细胞,转化的淋巴细胞,淋巴细胞转化实验 瑞氏染色 10×40,,,,3H—TDR掺入法 －－－淋巴细胞转化试验,T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过β-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。,MTT比色法 －－－淋巴细胞转化试验,MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。,,MTT,Formazan,Insoluble,1. 补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。
2. E花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察结果。
3. 绘制淋巴细胞转化试验（形态学法）镜下观察结果。,实验报告,第4次 实验课内容,免疫标记技术：ELISA
免疫病理实验
实验课考试,
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