微生物的遗传与变异.ppt

第八章 微生物的遗传与变异,遗传，指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。 遗传性：指生物的亲代传递给其子代一套遗传信息的特性。 基因型：指生物体所携带的全部基因的总称。 表型：指遗传特性在一定环境条件下的具体表现。 变异：指遗传型的改变，即生物遗传物质结构或数量的改变。 饰变：同样遗传型的生物，在不同的外界条件下呈现不同的表型。,微生物与遗传学研究：,个体结构简单；营养体多为单倍体；易于在成分简单的合成培养基上生长繁殖；繁殖速度快；易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对各个体作用具有直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；一般都有相应的病毒；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。 研究现代遗传学和重要的生物学基本理论问题，微生物是最佳材料和研究对象。,第一节 遗传变异的概念及物质基础,一、基本概念 （一）、遗传型、基因型：某一生物个体所含有的全部遗传因子（基因的总和）。 具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。 ----------　　代谢----遗传型+环境条件------->表型--------------　发育----,（二）、表型：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 表型是一种现实性。,（三）、变异：在某种外因或内因的作用下，生物体遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。 变异特点：在群体中以极低的几率(一般为10-5～10-10)出现；性状变化的幅度大；变化后的新性状是稳定和可遗传的。,（四）、饰变：不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。 饰变特点：整个群体中每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；饰变性状不遗传。 例如，粘质沙雷氏菌25℃培养，产生深红色灵杆菌素，把菌落染成鲜血似的(因此过去称它为“神灵色杆菌”或“灵杆菌”)；37℃时，群体中所有个体都不产色素。重新降温至25℃ ，所有细胞产色素能力又可以恢复。,第一节 微生物遗传变异的物质基础,（一）转化实验 　　1944年美国洛克非勒医学研究所的Avery等人证实了1928年英国人Griffith的发现，并将肺炎链球菌SⅢ型的DNA成功的转化无毒性的肺炎球菌RⅡ型为有毒的肺炎球菌SⅢ型，第一次证明了载有肺炎链球菌SⅢ型荚膜遗传信息的物质是DNA。,最早进行转化实验的是英国的F. Griffith，他以肺炎链球菌作为研究对象。肺炎链球菌可使人患肺炎，也可使小鼠患败血症而死亡。 肺炎链球菌有许多不同的菌株，有荚膜者是致病性的，它的菌落表面光滑，故称S型；有的不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙，故称R型。,Griffith共进行了以下几组实验： 动物试验 细菌培养试验 S型菌的无细胞抽提液试验,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。,热死S菌—————不生长活R菌—————长出R菌热死S菌—————长出大量R菌和10-6S菌,活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,①加S菌DNA ②加S菌DNA及DNA酶以外的酶 ③加S菌的DNA和DNA酶 ④加S菌的RNA ⑤加S菌的蛋白质 ⑥加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。,Griffith的转化实验,（二）噬菌体的感染实验 　　1953年美国人Hershey和Chase用放射性同位素方法，提供了DNA是噬菌体遗传物质的直接证据。他们用含32P和35S的培养基培养大肠杆菌H，再用被标记的大肠杆菌Ｈ培养Ｔ2噬菌体，直至完全标记上32P和35S的T2噬菌体为止。用标记的T2噬菌体侵染没有标记的大肠杆菌Ｈ，结果表明，Ｔ2噬菌体外壳蛋白中有35S放射性并与细菌的细胞壁连接，而DNA部分则有32P放射性并进如细菌的细胞质中。这一事实说明，在噬菌体侵染细菌过程中蛋白质外壳留在细菌细胞外，只有DNA进入了细胞，又一次证明遗传物质是DNA，而不是蛋白质。,噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,,,,,,,,,噬菌体DNA 在宿主细胞内能产生噬菌体后代，这些T2噬菌体后代的蛋白质外壳的组成、形状大小等特性均与留在细胞外的蛋白质外壳一模一样。 说明决定蛋白质外壳的遗传信息是在DNA上，DNA携带有T2的全部遗传信息。,T2噬菌体的感染实验,（三）病毒拆开和重建实验 　　通过Fraenbkel－Conrat等在植物病毒领域中的著名实验，证明RNA是烟草花叶病毒的遗传物质。,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：,（1）RNA（TMV）­ 蛋白质（HRV） （2）RNA（HRV）­ 蛋白质（TMV）,MTV HRV,HRV MTV,,RNA作为遗传物质,植物病毒的重建实验,用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,遗传物质在细胞中的存在方式,（一）、细胞水平：核或核质体 （二）、细胞核水平：核内染色体(核基因组)，核外染色体（真核质粒、质体－线粒体、叶绿体；原核质粒：F因子性因子、R因子抗性因子、Col质粒产大肠杆菌素因子、Ti质粒诱癌、巨大质粒固氮、降解性质粒降解复杂物质） （三）、染色体水平 ：数目，倍数 （四）、核酸水平：DNA，RNA,三、遗传物质在细胞中的存在方式,（五）、基因水平 ：具有特定核苷酸顺序的核酸片段，具有自主复制能力的最小遗传功能单位。相对分子量约为6.7×105Da，1000--1500bp( 碱基对)，每个细菌一般含有5，000—10，000个基因。,三、遗传物质在细胞中的存在方式,（六）、密码子水平：决定3个核苷酸顺序（AA）的片断，遗传的信息单位。 43=64＞20－23，出现一种以上密码子编码同一种氨基酸的现象。有些被用作“起读”(AUG)或“终止”信号(UAA、UGA和UAG)。 （七）、核苷酸、碱基水平：最低突变单位或交换单位（A、G、T、C）。,三、遗传物质在细胞中的存在方式,原核生物的基因调控系统是由操纵子（启动基因、操纵基因、结构基因）和调节基因组成。 结构基因决定多肽(酶及结构蛋白)的合成，操纵基因与结构基因紧密连锁在一起的，控制结构基因转录的开放或关闭。启动基因是转录起始部位。 调节基因一般与操纵子有一定间隔距离(一般小于100个碱基)，调节结构基因的活动。,三、遗传物质在细胞中的存在方式,顺序：启动基因－操纵基因－结构基－调节基因 关闭转录：调节基因转录出自己的mRNA,经翻译产生阻遏蛋白,识别并附着在操纵基因上，相互作用使DNA双链无法分开，阻挡RNA聚合酶沿着结构基因移动。 启动转录：阻遏蛋白从操纵基因上解除；依赖于DNA的RNA多聚酶附着在启动基因上，通过操纵基因，沿着结构基因移动，转录mRNA。,三、遗传物质在细胞中的存在方式,真核生物的基因：没有操纵子结构，存在不编码序列和重复序列，转录与翻译有空间分隔，基因之间被许多无编码功能的内含子阻隔。,原核生物的质粒,cccDNA：游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子。1984，天蓝色链霉菌等，发现线形质粒。 某些质粒具有与核染色体整合和脱离的功能，如F因子，称“附加体”。 分子量一般在106～108Da，大小约为1%核基因组。携带染色体上没有的基因，赋予某些特殊功能，例如接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解有毒物质等。 质粒消失不会造成菌体死亡 。,四、原核生物的质粒,质粒复制与核染色体同步，称“严紧型复制控制”，细胞一般含1～2个质粒；不同步，称“松弛型复制控制”，一般含10～15个或更多。 质粒之间及质粒与核染色体之间可以发生重组。 少数质粒可以在不同菌株间发生转移，如F、R等。 遇吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子或高温等因素，可使子代细胞中质粒消失。,四、原核生物的质粒,（一）、F因子、致育因子或性因子：E.coli等细菌中决定性别。约等于2%核染色体DNA的小型cccDNA。分子量为6.2×107Da，94.5kb（千碱基对），其中有1/3的基因与接合作用有关。,四、原核生物的质粒,（二）、R因子、R质粒： 多数由相连的两个DNA片段组成。其一称RTF质粒(抗性转移因子)，含有调节DNA复制和拷贝数的基因及转移基因，有时还有四环素抗性基因。11×106Da。其二为r质粒（抗性决定质粒），几百万至100×106Da以上。含其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素、安比西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,,一种可通过接合而转移的R因子的形成(IS因子是转座因子，可使RTF质粒和r决定质粒结合),四、原核生物的质粒,（三）、Col因子、产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是E.coli某些菌株分泌的细菌毒素，具有通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等，专一地杀死其他肠道细菌的功能。约4～8×104Da。 携带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,四、原核生物的质粒,（四）、Ti质粒、诱癌质粒：大型，长200kb。 根癌土壤杆菌侵入到双子叶植物细胞中，Ti质粒片段与植物细胞核染色体组发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，转变成癌细胞。 植物遗传工程研究的重要载体。外源基因可借DNA重组技术插入到Ti质粒中，进一步整合到植物染色体上，改变遗传性，培育优良品种。,四、原核生物的质粒,（五）、巨大质粒：200～300×106Da，比一般质粒大几十倍至几百倍。 根瘤菌属中发现，具有一系列固氮基因。,四、原核生物的质粒,（六）、降解性质粒：可编码降解复杂物质的酶，利用一般细菌难以分解的物质作碳源。如CAM(樟脑)质粒，OCT(辛烷)质粒，XYL(二甲苯)质粒，SAL(水杨酸)质粒，MDL(扁桃酸)质粒，NAP(萘)质粒和TOL(甲苯)质粒等。 仅在假单胞菌属中发现。,第二节 微生物突变 突变（mutation）指遗传物质--核酸（DNA或RNA）中的核苷酸顺序突然发生了稳定的可遗传的变化。突变包含基因突变和染色体畸变，基因突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起的。,（一）基因突变类型,按内部结构： 1、基因突变（点突变）：一对或少数几对碱基发生改变。 2、染色体畸变：DNA的大段变化(损伤)，表现为插入、缺失、重复、易位和倒位。 按表型特征： 1、形态突变型：细胞或菌落形态改变。 2、生化突变型--代谢途径发生变异而形态没有明显变化。分营养缺陷型、抗性突变型和抗原突变型。,（一）基因突变类型,A、营养缺陷型：基因突变引起代谢过程中某种酶的合成能力丧失，必须在原有培养基中添加细胞不能合成的营养成分才能正常生长。 B、抗性突变型：能抵抗有害理化因素，分抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等。 C、抗原突变型--细胞成分尤其是细胞表面成分(细胞壁、荚膜、鞭毛)的细微改变而引起抗原性变化。,（一）基因突变类型,3、致死突变型--基因突变导致个体死亡。 A、条件致死突变型：突变后，在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖。例如，E.coli的某些菌株可在37℃下正常生长，不能在42℃下生长等。 B、其他突变型：如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性等。,（一）基因突变类型,按分离： 1、选择性突变：具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长,从而取代原始菌株。如营养缺陷型或抗性突变型等。 2、非选择性突变：没有选择性标记，只有一些性状的数量差别。例如菌落大小、颜色深浅及代谢产物量的多少等。,基因突变的一般特性,1、非对应性：突变的发生与环境因子无对应性。 2、稀有性：自发突变的频率（突变率）很低，一般在10-6－10-10。 3、规律性：特定微生物的某一特定性状的突变率具有一定的规律性。,基因突变的一般特性,4、独立性：引起各种性状改变的基因突变彼此是独立的。 5、稳定性：突变是遗传物质结构的改变，因此是可以稳定遗传的。 6、回复性：同样的原因也可以导致突变的回复，使表型回复到野生型状态。 6、可诱变性：通过理化因子等诱变剂的诱变作用可提高自发突变的频率，但不改变突变的本质。,一、基因突变的自发性和突变结果与原因不对应性的证明 人们通常认为，某种细菌从对药物敏感到产生抗性是由于药物长期作用于细菌的结果，但实际上，对药物的这种抗性突变与接触药物无关，即突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。后来，人们通过几个严密的科学实验后终于证明，在接触抗性因子之前便已出现了抗性菌落。最著名的实验有：变量试验、涂布试验、影印培养试验,（一）变量试验 1943年，鲁里亚（S.E.Luria）和德尔波留克（M.Delbruck）首先设计。其要点是：先将大肠杆菌液分成等量的两部分。一部分装在大试管里，另一部分装在50支小试管里，将大小试管里的大肠杆菌放在恒温箱里培养，经过24到60小时后分别接种到固体培养基上。一只大试管分接50副培养皿，而50支小试管，每支接一副培养皿。每皿固体培养基里有等量的噬菌体，能生长的大肠杆菌是抗噬菌体的突变体。所得结果是，从一支大试管里长出来的菌落，也就是抗噬菌体的数量比较一致，即使有差异，也仅仅是实验上的误差。而由50支小试管长出来的抗噬菌体菌落，在数量上的差异较大。这说明抗噬菌体突变体是在接触噬菌体前在一次细胞分裂过程中随机自发产生的。这一自发突变发生得越早，则抗噬菌体菌落出现得越多，反之越少。抗噬菌体突变体的出现与是否接触噬菌体无关。,（二）涂布试验 1949年Newcombe设计的试验，其要点：在12个平板上涂上数目相等的敏感于T1噬菌体的大肠杆菌，经5小时的培养，在皿上长出大量的微菌落，取其中6皿直接喷上T1噬菌体，另6皿则先用灭菌玻棒把微菌落重新均匀涂布一次后同样喷上等量的T1噬菌体，培养后发现，涂布过的一组有抗性菌落353个，比未涂布过的（仅28个菌落）高得多。这说明该抗性突变发生在未接触噬菌体前，噬菌体的加入不是诱导突变的因素。,（三）影印培养试验 所谓影印培养法，实质上是使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法。1952年J.Lederberg夫妇首先进行的实验，是通过使菌不接触抗性环境而检查其抗性菌落出现的方法来证明的。方法要点是：包有灭菌丝绒布的木质圆柱（直径略小于培养皿底）为印章，用不具抗性环境（如不加抗生素等）的完全培养基进行培养，以印章轻轻粘取菌落，然后再一一接种到不同的选择培养基（如含有不同抗生素等）上，培养后，对各培养皿相同位置上的菌落作比较，便可选出相应的突变型菌落。,影印接种法,二、自发突变 自发突变：指微生物在没有人工参与下所发生的突变。 自发突变可能的机制： （一）背景辐射和环境因素的诱变  例如：充满宇宙空间的各种短波辐射、高温的诱变效应以及自然界中存在的诱变物质的作用。由于长期受到原因不详的诱变因素的综合效应，便发生自发突变。 （二）微生物的代谢产物的诱变  通常存在于细胞内的天然物质，如：过氧化氢、咖啡碱、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸等。它们既是微生物的代谢产物，又可以引起微生物的自发诱变。 （三）环出效应  在DNA复制的过程中，如果其中某一单链上偶尔产生一小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。,诱发基因突变的因素,紫外线、电离辐射（X线、 γ线和快中子等） 羟胺、亚硝酸或含亚硝酸化合物 烷化剂（甲醛、氯乙烯、氮芥等） 碱基类似物：以假乱真， 5-溴尿嘧啶（5-BU）、2-氨基嘌呤（2-AP） 造成DNA增加或减少一、二个碱基：丫啶类染料，氮芥类衍生物等。,病毒等生物因素,如麻疹病毒、流感病毒、疱疹病毒等，是诱发突变的明显因素。,三、诱发突变 （一）物理因素的突变 1.紫外线  紫外线的大剂量作用可导致菌体死亡，小剂量则可引起突变。其主要生物学效应是其对DNA的作用。其中主要机制是胸腺嘧啶二聚体的形成，它可在同一条链或两条链上发生。但发现形成的复合物暴露在可见光下，会使胸腺嘧啶二聚体重新解聚成为单体，此过程称为光复活作用。在紫外线照射进行诱变育种工作时，必须在红光下进行处理或操作，并在黑暗条件下培养，以免发生光复活作用。,2.X射线和γ射线 X射线和γ射线是不带电的光量子，不能直接引起物质电离，但在与原子或分子碰撞时，能把全部能量或部分能量传给原子而产生次级电子，这些次级电子具有很高的能量，使产生电离作用，从而直接或间接的改变DNA的结构。其直接效应是使碱基间、DNA间、糖与磷酸间相接的化学键断裂；间接效应是，电离作用引起水或有机分子产生自由基作用于DNA分子，导致缺失或损伤。,（二）化学因素的诱变 1.碱基结构类似物   这是一类与正常碱基结构（A、T、C、G）相似的物质，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-脱氧尿嘧啶（5-dU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤等，它们能掺入DNA分子中而不妨碍DNA的正常复制，但其发生的错误配对便可引起碱基对的置换，出现突变。这类代谢类似物只有对正常进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞，游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。,2.与核酸上碱基起化学反应的诱变剂   有些化合物能与DNA分子的某些基团起化学反应，如亚硝酸可使碱基脱氨，脱去的氨基被羟基取代，从而使A、G、C分别转变成H（次黄嘌呤）、X（黄嘌呤）、U（尿嘧啶），复制时它们便与C、G、A配对。,3.移码诱变   吖啶类化合物,如原黄素、吖啶橙、吖啶黄、a-氨基吖啶等是一类染料，具有扁平结构，能插入到DNA分子的碱基对之间，使DNA结构变形，在复制时产生不对称交换，从而引起在DNA链中插入或缺失一个或几个核苷酸，造成这一对核苷酸以后所有密码发生移动，产生移码突变。,移码突变,移码突变：由于DNA序列中发生1-2个核苷酸的缺失或插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致从改变位置以后的氨基酸序列的完全变化。,同义突变,同义突变：这是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化，显然，这是与密码子的简并性相关的。,错义突变,错义突变：是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至使之完全无活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变。,镰形细胞贫血,该病呈不完全显性遗传。由于β链第6位谷氨酸被缬氨酸所取代，即转录的mRNA密码由 GAG(谷氨酸)变成 GUG(缬氨酸)，形成镰形细胞血红蛋白HbS ，HbS比正常血红蛋白HbA溶解性小，在脱氧状态下结晶出来，形成小杆状，使红细胞变得僵硬，呈镰刀状改变。,镰形细胞不能通过小动脉和毛细血管，使小血管堵塞，引起局部组织的缺氧，继发感染，一过性剧痛，急性大面积组织损伤，心肌梗死。 镰形细胞的变形性降低还可引起溶血性贫血。HbS纯合子表现为镰形细胞贫血，杂合子HbAHbS仅表现镰形细胞性状，多数无症状，但也可有轻度慢性贫血。,镰形细胞贫血,终止密码突变,DNA分子中的某个终止密码突变为编码氨基酸的密码，从而使多肽链的合成仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。,无义突变,无义突变：是指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子（UAA，UAG，UGA）。蛋白质合成提前终止，产生截短的蛋白质。,表型突变,营养缺陷型 抗药性突变型 条件致死突变型 形态突变型,营养缺陷型,一种缺乏合成其生存所必须的营养物的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物才能生长。 基因型：hisC、tryA。表现型： HisC、TryA。 hisC–、tryA– 。 hisC+、tryA+ 。,抗药性突变型,由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的一种突变型，普遍存在于各类细菌中，也是用来筛选重组子和进行其他遗传学研究的重要下选择标记。 Strr、 strs。,条件致死突变型,是指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变菌型。 常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts表示。在42℃致死、25~30 ℃能生长。 影印法筛选。,形态突变型,是指造成形态改变的突变型，包括影响细胞和菌落形态、颜色以及影响噬菌体的噬菌斑形态的突变型，这是一类非选择性突变，形态突变和非形态突变均同样生长在平板上，只能靠看得见的形态变化进行筛选。其中以颜色变化较易筛选。,DNA损伤修复,由理化因子造成的DNA损伤是可以修复的，受损伤DNA和遗传信息可以从未受伤的互补链获得。 DNA损伤修复：是在细胞中多种酶的共同作用下，使DNA受到损伤的结构大部分得以恢复，降低了突变率，保持了DNA分子的相对稳定性。,修复方式,光复活 切除修复 重组修复,光复活,紫外光对DNA的损伤，其主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。 光复活：在可见光下，生物体的光复活酶激活，能识别并作用于嘧啶二聚体，将它分解为单体状态，使DNA的构型恢复正常。这是生物体普遍存在的功能。,切除修复,主要过程： 首先由核酸内切酶识别DNA损伤部位，并在5′端作一切口中，再在外切酶的作用下从5′→ 3′端方向切除损伤DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下以损伤处相对应的互补链为模板合成新的DNA单链片段来填补切除后的空隙，最后在连接酶作用下将新合成的单链片段与原有的单链以3′、 5′磷酸二酯键相连接完成修复过程 。,切除修复功能广泛存在于原核生物和真核生物 中，也是人类细胞中DNA损伤修复的主要方式之一。,切除修复,重组修复 ——旁路修复,通过细胞间期DNA合成期来修复损伤。,重组修复的过程,复制：越过损伤部位复制。而在有损伤的DNA的对应处留下缺口。 重组：在DNA损伤诱导产生的重组蛋白作用下，完整的母链与有缺口的子链重组，缺口由母链来的核苷酸片段弥补。 再合成：重组后，母链中的缺口通过DNA多聚酶的作用，合成核酸片段，然后由连接酶使新片段与旧链连接，至此重组修复完成。,重组修复不能除去受损伤的DNA，但保证了DNA复制的进行。若干代以后，损伤的DNA链逐渐(稀释)，最后无损于正常生理功能，损伤也就得到了修复。,重组修复,四、诱变育种 诱变育种是指通过人工方法处理微生物，使之发生突变，并运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。,第三节 基因重组   把两个不同性状的个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）。    原核微生物的基因重组方式主要有转化、转导、接合等形式。,一、转化（transformation） 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化（transformation)。转化后的受体菌，就称转化子（transformant）。 受体菌：只有处于感受态的细菌才能吸收外源DNA实现转化。细菌的感受态是一种生理状态，它可以通过感受态因子，一种蛋白质因子在细胞间的转移而获得；也可由某些生长条件诱导而成，如受体菌由丰富培养基转移到贫瘠培养基时约15%的枯草杆菌进入感受态。也与培养时间有关，如肺炎球菌的感受态出现在对数期后的40min。,转化过程示意图,二、转导（transduction）   通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把一个细胞（供体细胞）的DNA片段转移到另一个细胞（受体细胞）中，并使后者发生遗传变异的过程，称为转导(transduction)。通过转导获得部分供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞，称为转导子。携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。在噬菌体内仅含有供体DNA的称为完全缺陷噬菌体；在噬菌体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的称为部分缺陷噬菌体（部分噬菌体DNA被供体DNA所替换）。,三、接合（conjugation) 通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程，称为接合(conjugation)。 接合菌株与F因子 在细菌中，接合现象研究的最清楚的是大肠杆菌。大肠杆菌有性别分化。决定其性别的因子是F因子（即致育因子或称性质粒），这是一种在染色体外的小型独立环状DNA单位。F因子是一种属于附加体（episome）的质粒，它既可脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（即整合）到染色体组上。由于F因子在细胞中的有无和存在方式的不同，可把大肠杆菌分成4种接合类型：F+（雄性菌株）、F-（雌性菌株）、Hfr（高频重组菌株），F'菌株。,F因子的存在和转移方式,（三）几种杂交结果 1、F+菌株和F-菌株接合的结果是产生二个F+菌株。 2、F'菌株和F-菌株接合的结果是产生二个F'菌株。 3、Hfr菌株和F-菌株接合，在大多数的情况下，受体细菌仍然是F-，只有在极少数的情况下，由于遗传物质转移完整，受体细菌才能成为Hfr菌株。,第四节 基因工程   基因工程（gene engineering）指基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质（DNA大分子）提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在其中"安家落户"，进行正常的复制和表达，从而获得新的物种的一种崭新的育种技术。,一、基因分离 1、提取供体细胞的DNA，加入专一性很强的限制性核酸内切酶，从而获得带有特定基因并露出称为黏性末端的DNA。 2、提供作为载体的细菌质粒（也可用噬菌体或病毒作载体）。其中DNA也可用同样的限制性核酸内切酶切断，露出其相应的黏接末端。 二、体外重组   把供体细胞的DNA片段和质粒DNA片段放在试管中，在较低的温度（5～6℃）下混合“退火”，当两者混合在一起时，凡粘接末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双键。这时，在外加连接酶的作用下，供体DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝合”，形成一个完整的有复制能力的环状重组体，及“杂种质粒”。,三、载体传递 通过载体把供体的遗传基因导入受体细胞内。载体必须具有自主复制的能力。 四、复制表达   “杂种质粒”进入受体细胞后，能通过自主复制而得到扩增，并使受体细胞表达出为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。 五、筛选、繁殖   重组后的"杂种质粒"的性状是否符合原定"蓝图"，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等还需要经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个体，然后才可加以繁殖和利用。,第五节 菌种退化、复壮和保藏 在微生物的研究中，要保持一个优良菌株的遗传稳定性是一件艰苦的工作。菌种退化就是一种潜在的威胁。,一、菌种退化现象   菌种退化（degeneration）指群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象。常表现为，在形态上的分生孢子减少或颜色改变，甚至变形；在生理上常指产量的下降。,二、退化菌种的复壮   因为在退化的菌种中仍有一些保持原有菌种特性的细胞，故有可能采取一些相应措施，使这些细胞生长、繁殖，以更新退化的菌株，称之为菌种的复壮。常用的方法是单细胞分离、纯化、扩大培养。,,,三、菌种的保藏 经诱变筛选、分离纯化以及纯培养等一系列艰苦劳动得到的优良菌株，能使其稳定的保存、保持原有的特性、不死亡、不污染，这就是菌种保藏的任务。 （一）原理 人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。 （二）常用方法 1、斜面保藏法 将菌种接种在斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃冰箱中保藏，每隔一定时间再转接到新的斜面培养基上，生长后继续保藏。此方法简单、存活率高，故应用较普遍。其缺点是菌株仍有一定的代谢强度，传代多则菌种易变异，故不宜长时间保藏菌种。,2、液体石蜡覆盖保藏法 为了防止传代培养菌因干燥而死亡，也为限制氧的供应以削弱代谢水平，在斜面或穿刺的培养基中覆盖灭菌的液体石蜡。本法的优点是方法简单不需特殊装置。 3、载体保藏法   使微生物吸附在适当的载体上（土壤、沙子等）进行干燥保存的方法。最常用的有土壤保藏法。主要用于能形成孢子或孢子囊的微生物的保存。此方法简便，保藏时间长，微生物转接也较方便，故应用范围较广。,4、悬液保藏法 使微生物混悬于适当媒液中加以保藏的方法，其中蒸馏水保藏法较为常用。酵母菌、霉菌和放线菌的大部分均适用此法保存。操作方法简便。 5、寄主保藏法 某些微生物只能寄生在活着的动物、植物或细菌中才能繁殖传代，故可针对寄主细胞或细胞的特性进行保存。如噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。,6、冷冻干燥保藏法 这是最佳的微生物保存法之一，保存时间长。低温冷冻可以用普通-20 ℃或更低的-50 ℃、-70 ℃冰箱，用液氮（-196 ℃）更好。但是手续麻烦，需要高价设备，存活率低。 7、液氮保藏法   将菌种通过预冻后放在超低温(-196～-150 ℃)的液氮中长期保藏的方法。但必须将菌液悬浮于低温保护剂（如甘油、脱脂牛奶等）中，并须控制致冷速度进行预冻，以减少超低温对细胞造成的损伤。,谢谢！,