CE-SDS与SEC-HPLC比较.ppt

Page : 1 www.wison.com CE-SDS(非还原）与SEC-HPLC方法比较报告人：袁梵雨、谢敏、娄昆、陈小龙Page : 2 www.wison.com CE-SDS(非还原法）原理简介：毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。毛細管內先填充凝胶，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离，能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。Page : 3 www.wison.com CE-SDS(非还原）仪器组成毛细管电泳系统的基本结构包括进样、填灌/清洗、电流回路、毛细管/温度控制、检测/记录/数据处理等部分。Page : 4 www.wison.com CE-SDS(非还原）检测器Page : 5 www.wison.com CE-SDS(非还原）进样方式1. 流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样进样量：毛细管长度的1%-2%；nL级、非常小；2. 电动进样方式毛细管一端插入样品瓶，加电压。3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。Page : 6 www.wison.com CE-SDS(非还原）工作电压的确定1、在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压）2、做电压~电流曲线3、取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在150~400V/cm之 ， 的 。电泳温度的选择电泳温度的选 ， 毛细管 温度的选 控制。温度变 不 分离的 性， 分离效率。温度选 应 ：热效应控制、 性控制、分离效率控制 分离 对温度的 制等¡¢。£数⁄¥下，在20~30℃之 进ƒ电泳，就§currency1'“«的分离结果。Page : 7 www.wison.com 各试剂的作用• SDS-MW Sample Buffer： 由于蛋白是两性的，与SDS结合会使蛋白带负电荷，使其在毛细管中往正极方 移动。• 蛋白 ： 移时 的 。• ：与 离 ， 其 。样品¡理：在1.5mL离¢管中£⁄SDS-MW Sample Buffer 50µL， 蛋白 2µL， 10µL¥ƒ§currency1。'“试品 «2.5mg/µL）40µL，¥ƒ§currency1。‹离¢管›于70℃fifl£ 10min，–†¥ƒ§currency1，‡温· 。3000rpm离¢60s，'¶• 90µL‚PCR管中。CE-SDS(非还原）Page : 8 www.wison.com 2010„中”»…‰仪器的 ¿ `：毛细管：´性ˆ˜毛细管， ¯50μm˘75 μm使用较 。˙¨分离度 `， 选用20cm-100cm˚度。CE-SDS(非还原）‹流高压电›：fi用0-30kV（或fl ）可–†‹流电›，可‡应·300 μA电流。 ¶•压‚•流„”方式可‡选 。»洗进样系统：…‰进样之 毛细管 用不¿ `»洗。进样方式¶压力进样，´压进样，虹吸进样‚电动进样。通过控制压力或电压ˆ时 ˜控制进样量。检测系统：¯毛细管˘ 出口端的 ˙¨ ˚¸ 2mm一˝，˛ˇ— ，毛细管一 一 ˇ—¨ ，˛ ›¨ 在毛细管上， 过毛细管电 。对 吸 或Æ 的 的检测， 可fi用 ˘测定ª， 在作 »`中加入对 ¶吸 或Æ 的 加Ł，在 检测Ø口时出 Œ方º的 。Page : 9 www.wison.com ‰电泳¸ 的˝˛ˇ—pH：pH能˝˛样品的 离能力，样品在极性 的介 中离度 大，电泳速度 大， 而˝˛分离选择性˘分离 敏度。 CE-SDS(非 ）高电压 电压æ CE快速、高效的 ，电压 高，样品的ı 加大，分 时 łø 分离电压œ ，分离效果œ«ßæ 毛细管中焦耳热 大，基线•定性 ， 度 分 时 延长， 形变宽， 分离效率 ★ 分离电压：★ 温度 ：温度˝˛分离 性˘分离效率。温度 高， 度 Æ，分 时 减ª，分 效率 高。 温度 高，会 Ł毛细管Ø ¯ 温Œ 大，º 效 ，Ø效 Æ，分离效率 会 Æ。 Page : 10 www.wison.com SEC-HPLCæ (SEC)是 用 凝胶ı定 的 łł性，而øœ的 ß依¨分子 大小的Œ 来分离的 æ 方法。简介：分离机理：ı定 是 性凝胶，大分子不能进⁄凝胶 洞而完全被 ，只能沿凝胶粒子 的空隙通 æ Ø，首先被洗脱出来；中等大小的分子能进⁄凝胶中 些适当的 洞中， 不能进⁄更小的微 ，在Ø中受到滞留，较慢地被洗脱出来；小分子 进⁄凝胶中绝大部分 洞，在Ø中受到更 的滞留，会更慢地被洗脱出。