1、收稿日期：2015-10-16 录用日期：2016-01-18基金项目：福建省自然科学基金（2015J01358）*通信作者：zhangyiyuan_白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用机制研究张 韬 1，陈冬冬 2，翁 艳 2，冯尔宥 2，张怡元 2*（1. 厦门大学附属福州第二医院骨科研究所，2.厦门大学附属福州第二医院，福建 福州 350007）摘要：为探讨白花蛇舌草活性成分对骨肉瘤的作用及其机制，从白花蛇舌草中分别提取黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类，MTT 检测不同提取物对 MG-63 细胞活性的影响，同时建立裸鼠骨肉瘤移植瘤模型，观察不同提取物对移植瘤的生长抑制作用。并通过流式细胞仪
2、检测细胞凋亡及周期变化，western blot检测 Bax 及 Bcl-2 蛋白表达水平。结果显示四种提取物都对 MG-63 细胞的增殖具有明显抑制作用，呈现明显的剂量依赖性，最优药物浓度为 80g/ml。在最优药物浓度下四种提取物对裸鼠移植骨肉瘤也具有抑制作用。其中多糖类对MG-63 细胞活性和移植瘤的抑制作用都最强，明显促进了 MG-63 细胞凋亡，阻滞了细胞周期。Bax 表达量在 48 h 内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而增加，而 Bcl-2 表达量在 48 h 内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而降低。由上述结果可知，白花蛇舌草活性成分中多糖类的抗肿瘤活性最强，其作用
3、机制可能是通过抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡和阻滞细胞周期来达到抑瘤作用。关键词：白花蛇舌草；骨肉瘤；凋亡中图分类号：R965.1 文献标志码：A骨肉瘤是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，肿瘤恶性程度高，预后差，给家庭和社会带来极大负担。目前，手术是骨肉瘤最有效的治疗方法，但肉瘤位置特殊、术后转移和经济等均是影响患者治疗的因素，因此寻找其他经济、安全的保肢治疗方案尤为重要。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa，HD）属茜草科耳草属植物，清热解毒、消痛散结、利尿消肿、抗菌消炎、免疫调节及抗癌的功效，是中药用于治疗肺癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤等癌症复方中常用的单味药 1,2，但其
4、在骨肉瘤中的抗肿瘤作用鲜有报道。研究发现，HD 水提取物、乙酸乙酯萃取物、醇提取物都具有抗肿瘤作用，其有效成分有黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类等 3。本研究首先通过体外实验筛选 HD 有效成分中抑制骨肉瘤细胞株 MG-63 增殖最明显的成分，然后通过建立裸鼠移植瘤模型，观察 HD 有效成分对移植瘤增殖、骨肉瘤 MG-63 细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，并初步探讨其作用机制。1 材料与方法1.1 材料 人骨肉瘤 MG-63 细胞株（南京科佰生物） ， BALB/C 裸鼠（体重 182 g，吴氏实验动物中心） ，白花蛇舌草提取物黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类（福州大学中药研究所馈赠） ，
5、胎牛血清(Hyclone 公司)，DMEM 培养基(Hyclone 公司 )，MTT（Sigma） ，RIPA 裂解液、BCA 法蛋白定量试剂盒和UltraECL 底物化学发光检测试剂盒（Invitrogen，美国） ，鼠抗人 Bcl-2、Bax、内参 GAPDH，羊抗鼠 HRP 标记二抗（Abcam ，英国） ；Annexin-FITC-PI 凋亡检测试剂盒（凯基生物） 。1.2 细胞培养 将 MG-63 细胞接种于细胞培养瓶中，加入含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，置于 37 、5% CO2 培养箱中培养，每 48 h 传代 1 次，取对数生长期的细胞用于后续实验。1.3 MTT 法
6、 细胞生长至对数期后胰酶消化，培养基重悬，96 孔板中每孔加入 200 L 细胞悬液（510 3 个细胞/孔） 。加入 20 L HD 提取物（黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类） ，终浓度均为 10、20、40、80、160 g/mL，生理盐水作为阴性对照，相同终浓度顺铂作为阳性对照，每组重复 6 孔。培养约 24 h，待细胞贴壁后，弃培养基，每孔加入 20 L MTT（终浓度为 5 mg/mL） ，继续培养 4 h，弃上清，每孔加入 160 L DMSO，振荡 10 min，待结晶紫完全溶解后，酶标仪测定 492 nm 下吸光值（ A） ，计算细胞生存率，生存率=（实验组 A 值-空白组A
7、 值）/（对照组 A 值-空白组 A 值）100%。1.4 骨肉瘤裸鼠模型的建立 MG-63 培养至对数期后，调整细胞浓度至 5107/mL 细胞悬液。充分麻醉裸鼠后，无菌操作台上在裸鼠右后肢胫骨上端行 10 mm 纵切口，剪开皮肤，暴露胫骨上端。用 1 mL 注射器缓慢钻入胫骨结节和胫骨内侧髁之间的骨皮质，穿透后拔出。用微量注射器向胫骨髓腔中注入 0.2 mL 准备好的细胞悬液（约1107 个瘤细胞） ，边注射边会抽针头，注射完后用 5-0#缝线关闭切口。术后SPF 级独立送回风净化笼中饲料并观察成瘤情况。1.5 动物分组及给药 荷瘤裸鼠随机分为 5 组，即对照组：隔日给予同等剂量生理盐水灌
8、胃；黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类组 3，采用隔日灌胃给药，给药剂量为 50 mg/kg。20 d 后处死裸鼠，剥离移植瘤，称重，取平均值。1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡及周期 MG-63 细胞培养至对数期后调整细胞密度为 1106 接种于细胞培养瓶，5% FBS 的 DEME 培养基中继续培养 24 h，更换无血清的 DEME 培养基同步化培养 24 h，最后更换为 5% FBS 的 DEME 培养基，并加入终浓度为 80 g/mL 的多糖类提取物，分别培养 24 h 和 48 h。收集细胞，PBS 洗涤 2 次后用预冷的 70%酒精固定，4 过夜，离心去除固定液，PBS 洗涤 1 次，
9、收集的细胞加入预先配好的 PI 溶液，室温避光染色 30 min，流式细胞仪检测。1.7 Western Blot 细胞加药分别培养 0, 6, 12, 24, 48 h 后收集细胞，裂解细胞，取样品处理液进行 SDS-PAGE 电泳，转膜，用含 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液封闭 1 h。洗膜后将封闭后的 PVDF 膜与一抗 4 孵育过夜。洗膜后在室温条件下与二抗孵育 1 h，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（1:5 000） 。洗膜后加入免疫印迹化学发光试剂（ECL） ，显影、洗片、晾干。用凝胶图像分析仪扫描照片，并采用灰度分析计算各蛋白条带的灰度值。1.8 统计学处理 统计学软件为
10、SPSS13.0，数据以x s 表示，两样本均数采用 t 检验，p0.05 认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 白花蛇舌草提取物对 MG-63 细胞活性的影响白花蛇舌草四种主要提取物（黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类）都对 MG-63 细胞的增殖具有抑制作用，随着药物浓度增加，细胞生存率越低，呈现明显的剂量依赖性，但当药物浓度升高至 160 g/mL 时，细胞生存率与 80 g/mL 相比，差异无统计学意义（p0.05） 。另外，白花蛇舌草四种提取物中，多糖类对 MG-63 细胞的生长抑制作用最明显，IC 50 为 42.5 g/mL，在药物浓度为 20, 40, 80, 160 g/m
11、L 时，细胞生存率分别为 64.5%, 52.1%, 34.7%和 32.2%，都明显低于黄酮类、三萜酸类和香豆素类（p0.05） ，但明显高于阳性对照（p0.05） 。阳性对照：相同终浓度的顺铂图 1 白花蛇舌草提取物对 MG-63 细胞活性的影响 Fig. 1 The effect of HD on activity of MG-63 cells2.2 白花蛇舌草提取物对移植瘤的影响根据 MTT 实验结果，选择最优药物浓度 80 g/mL 作为裸鼠给药浓度，裸鼠移植瘤模型实验结果显示，所有裸鼠都成活，香豆素类、黄酮类、三萜酸类和多糖类裸鼠移植瘤（0.880.11, 0.390.12, 0.
12、750.13 和 0.220.07 g）都明显小于对照组（1.720.47 g） （p0.01） ；且多糖类处理骨肉瘤后的移植瘤最小，明显小于三萜酸类、黄酮类和香豆素类（p0.01） （图 2） 。(a)白花蛇舌草提取物处理后的骨肉瘤移植瘤，重复三次；(b) 白花蛇舌草提取物处理对骨肉瘤移植瘤的瘤重量的影响图 2 白花蛇舌草提取物对骨肉瘤瘤重抑制率的影响 Fig.2 The effect of HD on weight inhibition rate of osteosarcoma2.3 白花蛇舌草多糖类提取物对 MG-63 细胞凋亡及周期的影响采用流式细胞仪检测白花蛇舌草活性成分中抑瘤效果最
13、强的多糖类提取物对 MG-63 细胞凋亡和周期的影响（图 3） ，实验结果显示，加药 24 h、加药 48 h 后 MG-63 细胞凋亡率分别为 18.48%和 26.96%，明显高于对照组（加药 0 h）的 0.02%（p0.01） ，提示白花蛇舌草多糖类提取物明显促进了 MG-63 细胞凋亡，且随着加药时间延长，细胞凋亡率有所升高。另外，加药 24 h 后 MG-63细胞 G1 期、S 期和 G2 分别为 45.24%, 48.04%和 14.41%；加药 48 h 后 MG-63细胞 G1 期、S 期和 G2 占分别为 47.65%, 46.54%和 10.55%；对照组 MG-63 细
14、胞 G1 期、S 期和 G2 占分别为 34.57%, 67.33%和 11.32%；结果提示白花蛇舌草多糖类提取物具有阻滞细胞周期的作用，但随着加药时间延长，细胞周期阻滞效果不明显。图 3 白花蛇舌草多糖类提取物对 MG-63 细胞凋亡及周期的影响Fig. 3 The effect of HD polysaccharides on apoptosis and cell cycle of MG-63 cells2.4 白花蛇舌草多糖类提取物对 Bcl-2 和 Bax 表达的影响Western blot 实验结果显示，促凋亡蛋白 Bax 表达量在 48 h 内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延
15、长而增加，相反，抑制凋亡蛋白 Bcl-2 表达量在48 h 内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而降低（图 4） 。结果提示，白花蛇舌草多糖类提取物具有诱导 MG-63 细胞凋亡的作用。*表示与 0 h 相比差异显著，p0.05图 4 白花蛇舌草多糖类提取物对 MG-63 细胞 Bcl-2 和 Bax 表达的影响 Fig. 4 The effect of HD polysaccharides on expression of Bcl-2 and Bax in MG-63 cells3 讨论目前公认的骨肉瘤治疗模式是“术前新辅助化疗+肿瘤手术切除+术后辅助化疗” 。另外，介入治疗、冷热消融治
16、疗、中药治疗也是骨肉瘤的辅助治疗手段。还有一些治疗方法尚处于研究阶段，如基因治疗、免疫治疗、干细胞治疗和光动力治疗等。其中，中药是我国的国粹，临床报道证实中药同样能够为骨肉瘤治疗提供有效的方法。黄金昶等 4使用自制骨瘤消胶囊联合中药汤剂治疗 22 例骨肉瘤患者就取得了较好的治疗效果。白花蛇舌草抗肿瘤的活性成分有黄酮类（槲皮素、山奈酚） 、三萜酸类（熊果酸、齐墩果酸）甾醇类和多糖类等化学成分，临床上主要用 HD 多成分注射液 5。目前对其单一活性成分的抗肿瘤研究甚少。有研究表明，HD 可降低化疗药物引起的乳腺癌细胞毒性 6。大量研究也发现 HD 可诱导前列腺癌 7、宫颈癌8、肝癌 9、肾癌 10
17、、结肠癌 11、胶质瘤 12等细胞凋亡和抑制细胞增殖。少量研究发现 HD 也可诱导骨肉瘤细胞凋亡和增殖 13。本研究结果发现，HD 提取物中黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类都会抑制骨肉瘤 MG-63 细胞的增殖，最佳抑制浓度均为 80 g/mL。其中多糖抑制率最高，达 67.8%。另外，移植瘤实验结果显示，香豆素类、黄酮类、三萜酸类和多糖类裸鼠移植瘤都明显小于对照组（p0.01） ；且多糖类处理骨肉瘤后的移植瘤最小，明显小于三萜酸类、黄酮类和香豆素类（p0.01） 。实验结果还发现，黄酮类、三萜酸类、香豆素对 MG-63 细胞的抑制作用几乎相当，但三者对裸鼠移植瘤的抑制率却有较大差异，可能由
18、于三者在裸鼠体内吸收和代谢存在差异。我们进一步对抑瘤作用最强的多糖类提取物进行了研究，结果显示，白花蛇舌草多糖类提取物明显促进了 MG-63 细胞凋亡，且随着加药时间延长，细胞凋亡率有所升高。同时也具有阻滞细胞周期的作用，但随着加药时间延长，细胞周期阻滞效果不明显，可能药物作用时间并不是影响细胞周期的主要因素。通过分析白花蛇舌草多糖类提取物对 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达的影响，我们发现促凋亡蛋白 Bax 表达量在 48 h 内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而增加，相反，抑制凋亡蛋白 Bcl-2 表达量在 48 h 内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而降低。说明白花蛇舌草多糖
19、类提取物一方面激活 Bax 的表达，一方面抑制 Bcl-2 的表达，共同起到促进细胞凋亡的作用。综上所述，HD 提取物中黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类都具有抗肿瘤活性，其中多糖类抗肿瘤活性最强，其作用机制可能是通过抑制骨肉瘤细胞增殖、通过激活 Bax 表达并抑制 Bcl-2 的表达共同促进细胞凋亡，以及阻滞细胞周期等途径工作作用，最终达到抑制骨肉瘤的作用。参考文献:1 于晓勇, 曹红霞, 罗真. 骨肉瘤治疗的研究进展J. 中国医药指南 , 2014, 12(26): 77-78.2 杨英年. 骨肉瘤治疗进展J. 中国医药科学, 2014, 4(6): 49-52.3 马超. 白花蛇舌草抗肿
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21、J. Nat Prod Commun, 2014, 9(5): 699-700.7 Hu E, Wang D, Chen J, et al. Novel cyclotides from Hedyotis diffusa induce apoptosis and inhibit proliferation and migration of prostate cancer cellsJ. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(3): 4059-4065.8 高超 , 刘颖, 蔡晓敏, 等. 白花蛇舌草对 U14 宫颈癌抗肿瘤作用的实验研究J. 实用癌症杂志, 2007, 22(6
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24、1, Chen Dongdong2, Weng Yan2, Feng Eryou2, Zhang Yiyuan2*(1. Department of Orthopedics Institute, Fuzhou Second Hospital, 2. Department of Orthopedics, Fuzhou Second Hospital, Fuzhou 350007, China)Abstract: To investigate the effect of Hedyotis diffusa (HD) on osteosarcoma, MTT was used to detect th
25、e effects of flavonoids, triterpene acids, coumarin and polysaccharides extracted from HD on MG-63 cell activity. Osteosarcoma xenograft model in nude mice was established to evaluate the effects of HD extracts on growth of osteosarcoma. Apoptosis and cell cycle of MG-63 cells were detected by flow
26、cytometry, and western blot was performed to assay the expression of Bax and Bcl-2. Those four kinds of HD extracts significantly inhibited the proliferation of MG-63 cells with optimal drug concentration of 80 g/mL, and showed a significant dose-dependent manner. The HD extracts also inhibited the
27、growth of osteosarcoma under the optimal drug concentration. Wherein the HD extracts, polysaccharides showed the strongest inhibition both on proliferation of MG-63 cell and growth of osteosarcoma. It significantly promoted apoptosis and arrested cell cycle of MG-63 cells, and up-regulated expression of Bax and down-regulated expression of Bcl-2 in 48h. Among the HD extracts, polysaccharides showed the strongest inhibition on osteosarcoma, which may through inhibit proliferation, promote apoptosis and arrest cell cycle of MG-63 cells.Key words: Hedyotis diffusa; osteosarcoma; apoptosis
