1、 NY/T 2012 ICS 中国标准文献分类号 DB6 5德州驴 DNA亲子鉴定技术规程Technical Specification for DNA Parentage Identification in DEZHOU DonkeyT/CAAA中 国 畜 牧 业 协 会 发 布2018-发布 2018-实施中国畜牧业协会团体标准T/CAAA XXXX-2018T/CAAA 2018前 言本标准根据GB/T 1.12000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则相关要求制定。本标准由中国畜牧业协会提出。本标准由 全国畜牧业标准化技术委员会 归口。本标准主要起草单位：东阿阿胶股份有限公司
2、、中国农业大学、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、山东农业科学院奶牛研究中心、山东东阿黑毛驴牧业科技有限公司。本标准主要起草人：张新浩、赵春江、李海静、嵇传良、周祥山、杨莉、张莉、王长法、王敏、吕鑫、刘宇、崔冉、韩思勇、胡元岭、赵志超。T/CAAA 20181德州驴 DNA亲子鉴定技术规程1 范围本标准规定了德州驴 DNA 亲子鉴定的技术方法及结果分析等内容。本标准适用于德州驴亲子鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款对于本标准是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 6682 分析实验
3、室用水规格和实验方法GA/T 383 法庭科学 DNA 实验室检验规范SN/T 1193 基因检验实验室技术要求SN/T 1119-2002 进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法 PCR 方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1亲子鉴定 parentage identification利用分子遗传学、生物学及医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有血缘关系。3.2微卫星 DNA标记 DNA microsatellite又称为短串联重复序列(short tandem repeats, STRs)或简单重复序列（ simple sequence repeats） ，是分布于真核生物基因
4、组中的简单重复序列，由 26 个核苷酸的串联重复片段构成。重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富。4 鉴定原理根据微卫星 DNA 的侧翼保守序列设计荧光标记引物，通过多重 PCR 技术扩增不同个体的微卫星 DNA 位点。通过分型技术检测微卫星 DNA 标记的遗传多态性。分析亲代个体和子代个体各微卫星标记的基因型是否相符，以达到鉴定亲子关系的目的。5 主要试剂配置及器材5.1试剂5.1.1 乙二胺四乙酸二纳（EDTA） ，分析纯5.1.2 乙醇（Ethanol） ，分析纯T/CAAA 201825.1.3 异丙醇（Isopropanol） ，分析纯5.1.4 氢氧化钠（NaOH） ，
5、分析纯5.1.5 冰醋酸（CH3COOH） ，分析纯5.1.6 十二烷基硫酸钠（SDS） ，分析纯5.1.7 氯化钠（NaCl） ，分析纯5.1.8 乙酸钾（CH3COOK） ，分析纯5.1.9 琼脂糖（Agarose）5.1.10 盐酸（HCl） ，分析纯5.1.11 溴酚蓝（BPB） ，分析纯5.1.12 二甲苯（FF） ，分析纯5.1.13 蔗糖（Sucrose） ，分析纯5.1.14 缓冲液a、血液裂解缓冲液（Buffer A）：100 mM Tris-Hcl（PH 7.5） ，100 mM EDTA，100 mM 氯化钠，0.5 % SDS；b、蛋白沉淀缓冲液（Buffer B）：2
6、00 ml 5 M CH3COOH，500 ml 6 M LiCl；c、DNA 溶解缓冲液（ TE）：10 M Tris-HCl，d、电泳缓冲液 50TAE：2 M Tris-base，1 M 冰乙酸，0.1 M EDTA（PH 8.0） ；除另有规定外，标准中所使用试剂均为分析纯，水为参见 GB/T 6682 的双蒸水；高压灭菌条件为：1.03410 5 Pa、121 、20 min。e、琼脂糖电泳缓冲液：0.25 %溴酚蓝，0.25 % 二甲苯菁 FF，40 % 的蔗糖水溶液。5.2 器材5.2.1 单道可调移液器 2.5 l，10 l，100 l ，200 l，1000 l，5 ml5.
7、2.2 离心机，最高转数 14000 r/min5.2.3 电子天平，可精确到 0.001 g5.2.4 旋转混匀器5.2.5 PCR 扩增仪 0.2 ml96 孔5.2.6 恒温水浴锅5.2.7 蛋白质核酸分析仪5.2.11 微波炉5.2.12 冰箱T/CAAA 201835.2.13 高压灭菌锅，温度范围 45135 ，最大压力 0.255 Mpa6 亲子鉴定规程6.1 样本采集使用 EDTA 抗凝管静脉采集血样 2 ml5 ml 或带有毛囊的毛发， 4 或-20 保存。6.2 DNA提取采用试剂盒法从全血中提取基因组 DNA。具体方法参见附录 A。DNA 提取操作的注意事项参见 SN/T
8、 1193-2002。6.3 引物序列本标准中采用微卫星位点均采用国际动物遗传协会（ISAG）推荐及在德州驴上已被证实存在多态性的位点，包括 13 个位点：AHT4、HMS6、ASB23、HTG10、HMS3、HMS2、HTG7、HMS7、HMS18、TKY343、TKY312、TKY337、TKY297，引物序列及标记参见附录 B。6.4 微卫星标记扩增6.4.1 多重 PCR反应体系采用多重 PCR 的方法扩增上述位点，分 3 次 PCR 反应。 25 l反应体系：SuperMix10 l、 10 mol/L 引物（扩增组合）各 1 l、待测个体 DNA 模板 1 l，加双蒸水至 25 l
9、反应体系。6.4.2 扩增条件95 预变性 10 min，95 变性 30 s，55 60 退火 30 s（详见附录 B） ，72 延伸 30 s，30 个循环，72 延伸 10 min。6.4 基因型检测采用全自动 DNA 分析仪扫描电泳结果，根据荧光标记产物的大小确定上述 13 个微卫星位点的基因型。分析中设置基因型已知的对照样本。6.5 基因型表示方法基因型采用字母法表示，在检测的微卫星位点中，等位基因为奇数的，片段长度居中的基因型标记为“M” ；如果等位基因数为偶数，居中的两个基因型中片段较小的定义为“M”，其他片段的基因型按长度对照“M”左右排列。6.6 亲子关系判定根据两亲代及子代
10、的基因型判断其是否存在亲子关系，对于亲代和子代基因型不符的T/CAAA 20184个案，重新采样鉴定，两次结果一致可排除亲子关系。6.7 结果对比表参见附录 C7 检测过程中防止交叉污染的措施按照 SN/T 1193-2002 的规定执行。T/CAAA 20185附录 A（资料性附录）从血液或精液中提取 DNAA.1 规定了血液基因组 DNA提取血液基因组 DNA提取步骤A.1.1 用移液器吸取 100 l EDTA 抗凝血转入 1.5 ml 离心管中并做好标号。A.1.2 加入 400 l血液裂解缓冲液（Buffer A）充分混匀。A.1.3 将离心管用封口膜封口后，65 水浴 4 h，期间
11、每隔 0.5 h 颠倒混匀一次。A.1.4 加入 800 l 蛋白沉淀缓冲液（Buffer B） ，颠倒混合后置于冰上 10 min。A.1.4 用高速离心机在室温条件下 12000 r/min 离心 15 min。A.1.5 吸取上清液于新的 1.5 ml 离心管中，注意不能吸到沉淀层。A.1.6 加入 600 l异丙醇，颠倒混匀。A.1.7 常温 12000 r/min 离心 15 min。A.1.8 弃上清液，用 70 %乙醇清洗 2 次，室温静置 5 min。A.1.9 加入 100 l TE 缓冲液，溶解 30 min。A.1.10 采用 1 %琼脂糖凝胶电泳检测提取 DNA 质量；
12、采用蛋白质核酸分析仪测定 DNA浓度。A.1.11 短期内使用可 4 保存。-20 可保存 6 个月以上。附录 B（资料性附录）微卫星基因座及其引物序列B.1 规定微卫星基因座及其引物序列表 B.1 微卫星基因座及其引物序列表基因座 引物序列（5-3） 退火温度（） 片段范围（bp）T/CAAA 20186AHT4AACCGCCTGAGCAAGGAAGTGCTCCCAGAGAGTTTACCCT60 140 bp160 bpHMS7CAGGAAACTCATGTTGATACCATCTGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT60 167 bp187 bpHMS6GAAGCTGCCAGTATT
13、CAACCATTGCTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA60 154 bp170 bpASB23CTGGTGGGTTAGATGAGAAGTCGCAAGGATGAAGAGGGCAGC60 176 bp212 bpHTG10CAATTCCCCCCCCACCCCCGGCATTTTTATTCTGATCTGTCACATTT60 83 bp110 bpHTG7CCTGAAGCAGAACATCCCTCCTTGATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT60 114 bp128 bpHMS3CCAACTCTTTGTCACATAACAAGACCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT60 14
14、6 bp170 bpHMS2ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAGCTTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG60 215 bp236 bpTKY343TAGTCCCTATTTCTCCTGAGAAACCCACAGATACTCTAGA55 140 bp160 bpHM18CAACAATGAAAATTTGTCCTGTGCGTAAATGAGTAGACAATCATGAGG55 170 bp200 bpTKY312AACCTGGGTTTCTGTTGTTGGATCCTTCTTTTTATGGCTG55 100 bp110 bpTKY337AGCAGGGTTTAATTACCGAGTAGATGCTAATGCAGCACAG55 160 bp170 bpTKY297GTCTTTTTGTGCCTCTGGTGTCAGGGGACAGTGGCAGCAG55 210 bp240 bp附录 C 亲自关系对比图
