压电石英晶体免疫传感器检测尿液白蛋白的实验研究.doc

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1、Comment U1: 英文全称1表面等离子体免疫传感器同步定量尿液中多种微量蛋白的研究罗 阳 1,张 波 1,高维寅 1,陈 鸣 2,蒋天伦 3,刘星 1,王 珏 1,府伟灵 1 ( 1第三军医大学西南医院检验科,重庆 400038; 2第三军医大学大坪医院检验科,重庆 4000403第三军医大学西南医院输血科,重庆 400038;)摘要 目的 探讨并建立表面等离子体免疫传感器芯片同步定量尿液中多种微量蛋白的方法。 方法 采用 EDC/NHS方法将微量白蛋白(MA)、-1 微球蛋白(A1M) 、-2 微球蛋白(B2M)、尿 IgG的单克隆抗体固定于免疫传感器芯片之上,并用表面等离子体共振传感

2、器(SPR)检测样本中微量蛋白的含量。首先利用 4种微量蛋白的标准血清建立标准曲线,然后对其进行灵敏度、特异性等指标的方法学评价。并以免疫散射比浊方法为参考方法,检测 125例临床患者 24h尿液样本的微量蛋白浓度,并比较两种方法检测相同样本时的结果差异。结果 该表面等离子体共振免疫传感器芯片具有良好的操作性能和检测特异性。其标准曲线的R2均在 0.995以上。其检测灵敏度分别是 A1M为 5g/L,B2M 为 7.3 g/L,MA 为 11.5 g/L,IgG 为 22g/L。所有 4项指标可在 20分钟之内同步完成。与微量蛋白检测的经典方法免疫散射比浊相比,两者的相关性和一致性较高,且本检

3、测方法所需时间更短,检测成本更低。结论 表面等离子体免疫传感器芯片可实现尿液中多种微量蛋白的快速、准确、同步定量,为临床实验室检测尿液中微量蛋白提供了可靠的技术补充。关键词 表面等离子体共振;免疫传感器芯片;微量蛋白;检测中图分类号 R446.12 文献标识码 ASimultaneous determination of multiple trace proteins in urine by SPR biosensor Luo Yang1,Zhang Bo1,Gao Weiyin1, Chen Ming2, Jiang Tianlun3, Liu Xing1, Wang Jue1, Fu We

4、iling1 (1Department of Laboratory Medicine, 3Blood Bank, Southwest hospital, 2Daping 基 金 项 目 国 家 “863”项 目 ( 2007AA02Z416) , 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 30927002, 30900348) , 全 军 科 技 成果 推 广 扩 试 项 目 ( 08JKS01) , 军 队 科 技 攻 关 ( 08G089) , 重 庆 市 科 技 攻 关 项 目 ( CSTC,2010AA5042)通讯作者 府伟灵,电话:(023) 68754429, E-mail: ;2ho

5、spital, the Third Military Medical University,Chongqing 400038)Abstract Objective To establish a novel methodology for simultaneous quantification of four trace proteins in urine by SPR. Methods Monoclonal antibodies against Alpha-1 microglobulin, beta-2 microglobulin, microalbumin and Immunoglobuli

6、n G were immobilized on the surface of biosensor chips then the SPR was adopted to detect the according antigens in urine. Calibrations of the four proteins were performed and the methodological evaluations were conducted to validate the sensitivity and specificity. Clinical urine samples from 125 i

7、npatients were collected and detected both by SPR and Immuno-turbidimetric assay. Results The proposed SPR immunosensor has good signal-noise ratio and specificity. All the R2 of the calibration curves were higher than 0.995. The sensitivity of A1M is 5 g/L,B2M being 7.3 g/L,MA being 11.5 g/L,and Ig

8、G being 22 g/L. All the detection can be finished in 20 minutes. This proposed method has good consistency when compared with traditional Immuno-turbidimetric assay. Conclusion This proposed SPR immunosensor chip can accurately and simultaneously determine multiple trace proteins in urine, thus can

9、be a useful alternative to current methodology.Key Words SPR; immunosensor chip; trace proteins; detection;Supported by The National High Technology Research and Development Program of China (2007AA02Z416), National Natural Science Foundation of China (30927002, 30900348) ,Special Project of the “El

10、eventh Five-year Plan” for Medical Science Development of PLA (08JKS01,08G089), Foundation for Sci & Tech Research Project of Chongqing (CSTC,2010AA5042)Corresponding author: Fu Weiling, Tel:( 023)68754429, E-mail: ; 目前临床上对特种微量蛋白的定量检测方法主要以免疫比浊法、荧光免疫法、ELISA、放免法等为主。免疫比浊法自动化程度高,检测时间短,精密度优于放免法,为目前临床上常用的

11、特种微量蛋白检测方法,但其配套仪器及试剂价格昂贵,且仪器必须配合特定试剂使用 1;荧光免疫法结果准确,灵敏度高,但操作复杂、费时,且需荧光标记;ELISA 灵敏度、精密度均较高,操作简便,但无法3对特种微量蛋白进行准确定量;放免法具有灵敏度高、检出限低的优点,但需用125I 或 32P 等放射性核素标记,极易导致人体的放射性暴露。因此,临床上迫切需要建立一种准确、快速、无需标记、实时动态监测的检测方法 2。近年来,生物传感器在抗原-抗体复合物的快速检测方面已经获得大量研究进展,相继出现了利用表面等离子体共振(SPR) 、压电石英晶体微天平(QCM)、漏声表面波 (LSW)等能进行蛋白质快速检测

12、的传感器 3-9。SPR 因其具有无需标记,准确性高的特点在传感器领域取得了较快发展 10, 11。同时,采用光线反射原理的SPR 传感器可避免样本中干扰物的影响,因而可实现浑浊样本的检测,此特点在尿液、漏出液等较浑浊样本的临床实验室检测中具有极其重要的意义 12。常规的SPR 传感器采用单通道技术,每次仅能检测单个指标,故使其在临床的应用受到限制 13。本实验即在现有单通道 SPR 传感器的基础上,开发出适合于多蛋白指标检测的 SPR 免疫传感器芯片,以应用于临床实验室中对于浑浊样本尤其是尿液中A1M、 B2M、 MA、IgG 的同步检测,以期为临床实验室诊断浑浊样本提供一种新的技术方案。1

13、 材料与方法1.1 仪器与试剂人微量白蛋白(Microalbumin, ALB) 标准血清及其单克隆抗体、人 -1 微球蛋白(-1-microglobulin, A1M) 标准血清及其单克隆抗体、人 -2 微球蛋白(-2-microglobulin,B2M) 标准血清及其单克隆抗体均购自美国 Sigma-Aldrich 公司;人免疫球蛋白(Immunoglobulin G, IgG)及其单克隆抗体购自美国 Beckman 公司。PBS 缓冲液:0.05M ,pH 7.2,自行配制。所用其它试剂均为 AR 级。EDC、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS) 、牛血清白蛋白 (BSA)、葡聚糖均购自 Sig

14、ma 公司。1.2 方法1.2.1 金膜表面的预处理 将芯片浸入 1mol/L 的 NaOH 溶液中浸泡 10 分钟,用三蒸水清洗后,浸入 1mol/L 的盐酸(Hcl)溶液中浸泡 10 分钟,三蒸水及 95%乙醇清洗后,常温氮气吹干备用。1.2.2 抗体包被 抗体分子的固定按照课题组前期建立的方法进行 9。其主要过程如下:将上述处理后金膜的表面浸入 510-3mol/L 巯基十一烷醇的乙醇:水(体Comment U2: 请标示 此两种浓度标准品德配制Comment U3: 请添加检测临床样本前的对临床样本的处理方法。Comment U4: 符号不对4积比 4:1) 溶液中反应 6h,以形成亲

15、水性表面。然后浸入 0.6mol/L的表氯醇(溶剂为 0.4mol/L的氢氧化钠和二甘醇二甲醚 1:1的混合液)溶液中反应 4h。依次经去离子水、乙醇、去离子水彻底清洗后,在葡聚糖溶液(将 3g葡聚糖溶于 10mL的 0.1mol/L氢氧化钠溶液中)中处理传感表面 20h。浸入 1mol/L溴乙酸(溶剂为2mol/L的氢氧化钠)中反应 16h以形成羧甲基化基体,用于共价固定蛋白质分子;之后浸入 EDC和 NHS (1:1)的混合溶液 6h,来激活表面的羧基基团(-COOH);然后浸入浓度为 0.02mg/mL的抗 4种微量蛋白的单克隆抗体溶液 2h;最后用0.2mol/L的乙醇胺盐酸缓冲液来屏

16、蔽没有反应的 NHS和羧基形成的中间体。这样就完成了单克隆抗体在金膜表面的包被。1.2.3 标准品制备 初始配制 A1M、B2M、MA、IgG 标准品浓度均为1000mg/L, 对其稀释成以下浓度: 0.1、 1.0、 5.0、 10.0、 50.0、 100.0mg/L, 每 次检 测 时 标 本 的 加 入 量 为 10ul。1.2.4 重复实验和回收实验 分别对 20、50、100、500(g/L)四种浓度梯度的标准品进行批内检测(每批测定 20次)和批间检测(每天测定一次,连续测定20天) 。然后在 A,B,C,D 四根试管中分别加入低、高浓度的标准品以检测回收率。1.2.5 方法学比

17、较试验 收集 2010.3-2010.9 间 125例西南医院住院病人的 24h尿标本,其中男 70例,女 55例,平均年龄 37岁。采集后采用20低温保存。然后分别用 SPR传感器芯片和 IMAGE COULTER(免疫散射比浊方法)检测这些临床样品。1.2.5 SPR传感器特异性实验 配制浓度均为 100mg/L的A1M、B2M、 MA、IgG 标准品, 分 别 用 包 被 A1M、B2M、MA、IgG 单克隆抗体的 SPR依次检测上述标准品溶液,每 次 检 测 时 标 本 的 加 入 量 为 15ul。1.2.6 统计学分析 采用 SPSS15.0统计分析软件进行 X2检验,标准曲线和相

18、关分析采用 Origin 8.0作图,方法学比较实验(Bland-Altman)由统计软件 Medcalc 11.4绘制。Comment U5: 图中的浓度单位为nM,请与文章中的蛋白浓度 mg/ml相统一。52 结果2.1 SPR 传感器实时检测用传感器免疫传感器芯片检测 4种尿液中的微量蛋白,结果显示 1200秒时,抗原抗体反应达到了 70000毫度,且 B2M毫度最高,其次是IgG、A1M、ALB,在 3000秒时出现解离;B2M 的 SPR角度变化了 273毫度(图 1) ,经过减去参考值后,整个变化趋势显得更为明显、直观,便于分析。A:检测结果原始数据图;B:原始数据减去参考值的示意

19、图图 1 免疫传感器芯片检测尿液中微量蛋白的实时监测2.2传感器免疫传感器芯片检测的标准曲线 四种微量蛋白在相同检测条件下,随着加入微量蛋白浓度的升高,SPR角呈线性升高;所有四个蛋白的标准曲线进行线性拟合后 R2均高于0.98(图 2)10 10 1020510520530540 A-1MGB2L IgG SPR degr () Concetraion (M)图 2 四种微量蛋白的定标曲线62.3传感器再生实验分别采用 0.1mM 的 HCl, 30mM 的 EDTA 对 SPR 传感器芯片进行再生实验,结果表明,两种方法对芯片处理相同时间(10min)后,随着再生次数的增加,检测相同浓度标

20、准品时其 SPR 角的变化值逐渐减小,在 50 次再生循环以前,两种方法几乎都取得较好效果,但是在随后的再生次数中,EDTA 再生的下降幅度更大,说明在经过多次再生后,EDTA 对包被抗体的影响大于 HCl(图 3) 。0204060801023045067089010204060800120340560780910相对 SPR角()再 生 次 数 HCl EDTA图 3 分别用 HCL 和 EDTA 溶液再生次数与 SPR 角变化的关系2.4 SPR 传感器特异性实验用 MA、A1M、B2M 、IgG 单克隆抗体包被的 SPR 传感器分别对MA(微量白蛋白) 、A1M(-1 微球蛋白) 、B

21、2M(- 2 微球蛋白) 、IgG的标准血清逐一进行检测,结果表明,SPR 传感器和特异性的蛋白抗原结合,其 SPR 偏转角度都在 800以上,而和非特异性的蛋白结合后的 SPR 偏转角度均小于 4(图 4) 。7微 量 白 蛋 白 -1 微 球 蛋 白 - 2微 球 蛋 白 IgG02040608010SPR degre ()包 被 蛋 白 抗 体 的 SPR和 四 种 蛋 白 反 应 的 角 度 变 化微 量 白 蛋 白 -1 微 球 蛋 白 2微 球 蛋 白IgG图 4 SPR 传感器特异性实验2.5临床样本检测结果比较分别用两种方法(SPR 免疫传感器芯片法和免疫散射比浊法)检测相同的

22、样本共 125 例,检测结果运用 Altman-bland 曲线进行统计分析。所有的 Altman-Bland 曲线中横坐标为 SPR 技术和 IMN 技术检测的均值,纵坐标为两种方法检测的数据差值。结果显示,大部分数据都分布在均值的 2SD 范围内,且呈现均一的散在分布(图 5) 。0 5 10 15 20 25 30 353210-1-2-3-4-5 AVERAGE of A1M_INM_ and A1M_SPR_A1M_INM_ - A1M_SPR_ Mean-1.0-1.96 SD-4.+1.96 SD2.30 20 40 60 80 100 12020151050-5-10-15AV

23、ERAGE of B2M(INM) and B2M(SPR)B2M(INM) - B2M(SPR) Mean1.6-1.96 SD-9.8+1.96 SD13.10 10 20 30 40 5043210-1-2-3-4-5AVERAGE of ALB(INM) and ALB(SPR)ALB(INM)- ALB(SPR) Mean-0.7-1.96 SD-4.5+1.96 SD3.10 10 20 30 40 50 60 706420-2-4-6 AVERAGE of IG(INM) and IG(SPR)IG(INM)- IG(SPR) Mean-0.1-1.96 SD-4.3+1.96

24、SD4.0BAC D8A:125 例临床标本中 A1M 检测的结果;B:125 例临床标本中 B2M 检测的结果;C:125 例临床标本中 MA 检测的结果;D:125 例临床标本中 IgG 检测的结果图 5 四种尿微量蛋白分别进行 SPR 和 INM 检测结果的 Altman-bland 分析3 讨论尿微量蛋白的实验室检测结果对于糖尿病肾病具有重要的诊断价值。其中尿微量白蛋白更是其诊断性标志物 9。美国糖尿病协会规定尿液中微量白蛋白实验室诊断标准为浓度高于 300g/L,MA 结合小分子量蛋白(A1M 和 B2M)更具有诊断价值。然而其准确定量对于临床实验室则是一个难题,因为 B2M 在尿液

25、中的稳定性较差,尤其是在 pH5 的酸性尿中稳定性极差 10-13。为了能够准确定量 B2M,我们采用了 24H 尿液作为标本来源,并且在标本采集后立即加入 1M的 Hcl 或者 NaOH 使尿液标本的 pH 稳定在 7-8 之间,同时加入蛋白酶抑制剂,以防止蛋白的降解。检测结果显示其效果明显,说明该样本前处理方法是高度有效的。传感器再生实验结果表明,处理 SPR 芯片 DETA 和 HCl 在较少次数内(50次) ,效果相当;但在更多次数的再生处理过程中,经过 EDTA 处理的 SPR 芯片对其上包被的抗体影响较大,在对实验条件较为苛刻的芯片技术中,这种影响不能忽视。课题组进过认真分析初步认

26、为,DETA 对 SPR 芯片的再生实验的影响主要为 EDTA 和蛋白中的金属离子建立了螯合结构,使其少量结合在了 SPR 包被的抗体上,而 SPR 作为灵敏度极高的检测手段,少量的 EDTA 的残留也会带来再生实验的比较明显的差别,并且这种影响出现在较多次使用 EDTA 处理 SPR芯片的情况下 14。因此,为获得更佳的数据,后续试验均采用 HCl 溶液进行再生。建立或者改良一种新的检测方法,必须对其灵敏度、特异性、线性范围、检测时间等反映该方法性能的多方面指标进行评估。本方法核心为抗原-抗体结合反应,因此 SPR 的特异性主要由抗原抗体结合的特异性来决定。SPR 特异性实验结果显示本实验中

27、包被单克隆抗体的 SPR 和非特异性抗原蛋白结合,SPR 角度变化值在 4以内;而包被单克隆抗体的 SPR 和特异性抗原蛋白结合,SPR 角度偏转在 800以上。结果很清楚的显示,包被单克隆抗体 SPR 的特异性极高,检测体9系中所有的非特异性响应低,均在空白响应值内,不会互相干扰,能满足临床检测的需要 15。对于其他理化因素是否会对实验结果产生影响,还需进一步实验进行验证和探讨。本实验采用回收实验对 SPR 免疫传感器的准确度进行了验证。所谓回收实验即判断准确测定加入分析样品中的纯分析物的能力,其目的是测定比例系统误差,以衡量候选方法的准确度。本实验中,低浓度的回收率达到了 94.5%,中浓

28、度标准品的回收率达到了 106.57%,高浓度标准品的回收率达到了 105.68%,平均回收率为 102.25%,说明本实验的回收率较高,即准确度较高。从高、低浓度质控的检测来看,日内精度:xL=13.47、s xL=1.02、CV L=4.60%, xH=26.15、s xH=1.49、CV H=5.78%;日间差异: L=14.76、s L=2.90、CV L=17.68%, H=27.95、s H=3.66、CV H=13.1%。日内精密度已较高,无论是高值还是低值,CV 值都比较低,分别为 5.78 和 4.60%;但日间差异较大,分别为 13.1 和 17.68%。尽管如此,本方法测

29、定尿微量蛋白的结果仍较准确,能够满足临床检测需要。本方法的检出限以空白信号的均值加上 3 倍标准差来确定,以此得到免疫传感器芯片检测四种尿微量蛋白的检出限分别为:A1M 为 5g/L,B2M 为7.3g/L,MA 为 11.5g/L ,IgG 为 22g/L,检测灵敏度与放射免疫分析法相当,超过了 ELISA 法、火箭免疫电泳自显影法 16。但与上述标记免疫分析技术相比,主要表现在检测上限降低,其线性检测范围变窄。这主要由于传感器芯片表面积较小,抗体固定量相对减少造成的。由此看出,检测系统不能为了高集成、阵列化,一味追求传感器芯片的微小化。其后如何解决 SPR 传感器的微型化与传感器检测线性范

30、围的矛盾,达到最大限度微型化和最大检测范围的完美统一,还需进一步深入研究和探讨。无需标记是 SPR 检测技术的最核心优势,用于蛋白质与蛋白质间的反应检测具有得天独厚的优势。本方法与传统方法相比,加入缓冲液的平衡时间约为 3-5分钟,抗原抗体结合时间为 10-15 分钟。故在 37及适宜反应条件下,整个免疫反应可在 20min 内完成。本方法检测时间较 ELISA 或者免疫散射比浊方法缩短了2/3。如果单独测定蛋白质之间结合常数或者解离常数,则无需待整个反应完全结束即可得到所关心的数据,从而可进一步缩短检测时间。利用 SPR 传感器对 125 例临床标本分别进行 A1M、B2M、MA、IgG 检测,10其检测结果与相应的免疫散射比浊检测方法进行相关分析,其 R2 依次为:0.926、0.958、0.959、0.937。Altman-bland 分析结果表明,尽管两种方法存在一定的结果偏差,然而 98%以上的数据均处于 95%可信区间内,提示尿微量蛋白SPR 免疫传感器芯片的检测结果同传统免疫分析方法相比吻合度较高,可用于尿液中微量蛋白的临床检测,为尿微量蛋白的联合检测提供了一种简便、快速的新方法。

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