1、氚水内照射损伤的实验研究 （原稿）崔凤梅 1,2 胡明江 1,2 包广粮 3 孙 亮 1,2 王道锦 1,2 童 建 1,21（苏州大学医学部放射医学与公共卫生学院 苏州 215123） ； 2 （江苏省放射医学与防护重点实验室 苏州 215123） ；3（中国科学院上海应用物理研究所 上海 201800）摘 要 目的 探讨氚水染毒后小鼠外周血白细胞总数和骨髓嗜多染红细胞微核率的改变。方法 小鼠腹腔注入不同初始量的氚水，10d眼球摘除取血；小鼠腹腔注入同一初始量的氚水，2、4、6、10、28d眼球摘除取血；处死后取两侧股骨。计数外周血白细胞总数和骨髓嗜多染红细胞微核率。结果 随氚水初始注入量的
2、增加，骨髓嗜多染红细胞微核率相应增高（P0.05） ；而外周血白细胞总数相应降低，但只有初始注入量为16.65（10 5Bq/g）的剂量组差异有统计学意义。在相同初始注入量氚水时，随注入后时间延长，骨髓嗜多染红细胞微核率持续增加；外周血白细胞总数第2d至第6d持续下降(P0.05)，第10d后已恢复。结论 外周血白细胞和骨髓嗜多染红细胞微核可作为氚水染毒后的早期灵敏指标。关键词 氚水；小鼠；外周血白细胞；嗜多染红细胞；微核中图分类号 R818.03，R595.9，R818.74，R994.2，R994.690 年代，国内外学者对氚的有关生物学效应进行了一系列的研究 1-4，研究表明：低水平慢性
3、摄入氚水(HTO)可导致白血病和其他恶性肿瘤；HTO 多代照射可导致小鼠特定癌的数量增加, 氚剂量率与白血病发生率有密切关系；用 HTO和 3H-TdR 注射给小鼠, 可观察到小鼠精原细胞的恢复易位率和睾丸质量指数随剂量而变化。这些结果从各个不同的角度和层面描述了氚的内照射损伤效应，为后续研究积累了宝贵的经验。近年来，虽然开展了氚损伤的氧化应激研究及拓展了不同生物的基因损伤检测 5-6，但对氚内照射损伤的分子机理研究仍显得缺乏。随着近年来分子生物学技术的发展,在累积有关 DNA、蛋白质修饰和基因失活或激活的调控等方面理论的基础上, 从表观遗传学角度阐明氚内照射损伤的分子机理已成为可能。为此，本
4、课题组建立了氚水染毒小鼠模型，尝试从表观遗传学角度探讨氚水内照射损伤的机理。本文检测了氚水染毒小鼠外周血白细胞总数和骨髓嗜多染红细胞微核率，以期为后续表观遗传学相关指标的研究提供剂量和时间依据。1 材料与方法1.1 放射性核素氚水原液放射性浓度为 7.410 Bq/mL，注射前用灭菌注射用水稀释至需要的放射性浓度。1.2 实验动物及染毒实验用SPF级C57BL/6J小鼠40只，雄性，体重(202)g，由苏州大学实验动物中心提供，随机分成8组，每组5只，染毒及饲养均在江苏省放射医学与防护重点实验室的SPF动物房。1组对照小鼠腹腔单次注入灭菌注射用水，0.2mL /鼠。2组小鼠腹腔单次分别注入放射
5、性浓度为1.8510 7Bq/mL 和16.6510 7Bq/mL的氚水，单位体重注入量分别为1.8510 5Bq/g和16.6510 5Bq/g，10d后处死。另5组小鼠腹腔单次注入放射性浓度为5.5510 7Bq/mL 的氚水，单位体重注入量为5.5510 5Bq/g,分别于2d、4d、6d、10d、28d后处死。各组小鼠均眼球摘除取血后处死，收集脏器。1.3 外周血白细胞计数取白细胞稀释液 0.38mL ，抗凝血 0.02mL ，混匀，将混悬液滴在计数板上，静置 3min，在低倍镜下计数四角四个大方格的白细胞总数。白细胞总数（/L）=四格总数510 7。1.4 骨髓嗜多染红细胞微核计数取
6、两根股骨，用 2mL 小牛血清冲洗骨髓腔，收集至离心管中，1000rmin离心 3-5min，弃上清液，按血常规涂片法涂片，每鼠制备三张涂片，在空气中晾干，甲醇固定 510min，Giemsa 染色。先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分散均匀，细胞无损，染色良好的区域，转到油镜下进行计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色，微核大多数呈圆形或椭圆形，单个存在，边缘光滑整齐，嗜染性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。每只动物计数 10000 个嗜多染红细胞，微核率以千分率表示。1.5 内照射剂量估算小鼠单次接受氚水内照射，累积吸收剂量按下式 7估算：式中D为组织吸收剂量(Gy)； E为氚射线平均能量(5.710 -3
7、MeV )；q 0是初始注入量（Bq)； m是动物体重(g)；r(t)为小鼠体氚滞留函数；T为小鼠体氚有效半减期（d），由于氚的物理半衰期为12.33a，若不考虑组织结合氚，则有效半减期约等于体水氚的生物半排期，为2天 8。1.6 统计学处理所得数据以均数标准差表示，采用SPSS12.0统计软件包进行分析。微核采用泊松分布进行统计，方差分析比较组间差异。P0.05为差异有统计学意义。2 结果各组小鼠骨髓涂片上均可观察到嗜多染红细胞及微核，嗜多染红细胞呈灰蓝色，微核呈紫红色或蓝紫色，大多数呈圆形或椭圆形，单个嗜多染红细胞中可观察到一个或两个甚至三个微核，但大多数单个存在。氚水注入后不同时间和不同
8、初始注入量氚水对小鼠外周白细胞和骨髓嗜多染红细胞微核的影响见表1、2。由表 1 可见，随着氚水初始注入量的增加，累积剂量也增加，骨髓嗜多染红细胞微核率相应增大，与对照组比较，差异均有统计学意义；而外周血白细胞总数相应降低，但与对照组比较，初始注入量为 1.85 和 5.55（10 5Bq/g）的剂量组差异均无统计学意义，只有初始注入量为 16.65（10 5Bq/g）的剂量组差异有统计学意义。由表 2 可见，在相同初始注入量氚水时，随注入后时间延长，累积剂量增大，骨髓嗜多染红细胞微核率持续增加，与对照组比较，自第 4d 起差异均有统TdtrmEq05)(138.)0(计学意义。外周血白细胞总数
9、则表现出不同的变化趋势，具体来说，第 2d 至第6d 白细胞总数持续下降，至第 6d 时由对照组的 10.32(109)降至 7.31(109)，与对照组比较，差异均有统计学意义；10d 时，白细胞总数已有所回升，28d 时已恢复，与对照组比较，差异均无统计学意义。Table 1 effect on white cells and fMNPCE after different concentration tritium oxide injectedgroup concentration（10 5Bq/g）day（d）accumulative dose(mGy)white cells(109)f
10、MNPCE()0 0 10 0 10.320.69 2.160.301 1.85 10 40.68 10.170.68 3.710.47*2 5.55 10 122.05 9.340.74 5.210.68*3 16.65 10 366.16 8.120.56* 8.850.68*p0.05,vs control groupTable 2 change of white cells and fMNPCE in different days after tritium oxide injectedgroup concentration（10 5Bq/g）day（d）accumulative do
11、se(mGy)white cells(109)fMNPCE()0 0 0 0 10.320.69 2.160.301 5.55 2 62.99 9.220.76* 2.280.372 5.55 4 94.48 8.640.58* 3.450.49*3 5.55 6 110.24 7.310.72* 4.120.70*4 5.55 10 122.05 9.340.74 5.210.68*5 5.55 28 125.98 9.791.03 7.231.06*p0.05,vs control group3 讨论氚是氢的放射性同位素，经 衰变为稳定元素氦。环境和食物中含有天然氚，以氚气、氚水和有机结合
12、氚 3 种化学形态存在 ,它们通过呼吸、皮肤渗入或通过食物进入人体。此外，核电站、核爆炸和核反应堆运行也会释放大量的氚到环境中，浓度远远大于天然氚。随着核能事业的不断发展, 核反应堆的建立日益增多, 氚向环境中排放量将不断增加，对人类健康的影响将越来越受到重视。本课题组建立了氚水内照射损伤的动物模型，对氚水染毒后小鼠外周血白细胞总数和骨髓嗜多染红细胞微核率进行检测，为后续表观遗传学相关指标的研究提供剂量和时间依据。外周血白细胞特别是其中的淋巴细胞，对放射线非常敏感，早期就可以检测到其改变。实验发现，随初始注入量的增加，氚水染毒小鼠外周血白细胞总数相应下降，但只有初始注入量达到 16.65（10
13、 5Bq/g）时差异有统计学意义。初始注入量同为 5.55（10 5Bq/g）时，外周血白细胞总数随时间延长而改变，第 2-6d 持续降低，但到第 10d 时已回升，与对照组比较差异无统计学意义。由此可见，初始注入量为 5.55（10 5Bq/g）的实验组小鼠在第 10d 时外周血白细胞总数与对照组比较差异无统计学意义，是外周血白细胞已经回升了，而并非初始注入量过低的缘故。放射性核素进入机体后，按其衰变规律持续地释放粒子或射线，组织或器官的剂量是逐渐累积或叠加的，因此其损伤很多时候是随剂量的累积而加重。而氚水进入体内后具有与水相同的代谢特点，很快经尿、呼气和汗排除。对小鼠而言，若不考虑有机结合
14、氚，其有效半减期只有 2d，因此氚水进入小鼠体内后，比如初始注入量为 5.55（10 5Bq/g） ，则第 2d 累积剂量就达到 62.99 mGy，到第 10d 累积剂量达到 122.05 mGy，但到第 28d 累积剂量只增加了将近 4 mGy。可见，氚水进入小鼠体内后，大部分的剂量集中在前 10d。再加上实验染毒剂量仍然属于可恢复的低剂量，于是就观察到了外周血白细胞总数在 10d 内先降后升的现象。外界的各种理化因子若引起染色体的损伤，则细胞在有丝分裂后期，丧失着丝点的染色单体或染色体断片，到末期被子细胞所排除而形成次核，游离于细胞质中，其直径大约相当于细胞直径的 1/20-1/5，故称
15、微核，在骨髓和外周血液的有核细胞中均可见到。微核测试法在辐射领域内的应用已有 20 多年的历史，比染色体分析简单而快速。辐射诱导的微核率和微核细胞率随剂量增高而增加，其剂量-效应关系可拟合直线模式或二次多项式 9。本实验中观察到骨髓嗜多染红细胞微核率不仅随氚水初始注入量的增大而增高，而且还随注入后时间的延长而增高，直到第 28d 仍未恢复到对照组水平。说明，在氚水引起内照射损伤时，骨髓嗜多染红细胞微核可作为一个早期灵敏的指标，但仍然需要积累更多的剂量和时间分级的检测结果来估算其剂量-效应关系和时间-效应关系。通过对氚水染毒小鼠的外周血白细胞和骨髓嗜多染红细胞微核率的检测，初步阐明了一定剂量范围
16、内或同一剂量不同时间氚水染毒后内照射损伤的基本规律，为后续其它研究指标的剂量和时间选择提供了实验依据。参考文献1 Johnson JR, Myers DK, Jackson JS, et al. Radiat Res, 1995, 144(1):82-89. 2 BalonovM I,M uk sinova KN ,M ushkacheva GS. Health Phys, 1993, 65 (6): 713-726.3 高卫民,周湘艳.中华放射医学与防护杂志,1997，17(2)：130-133Gao Weimin, Zhou Xiangyan. Chin J Radiol Med Prot
17、, 1997，17(2)：130-1334 邹淑爱.氚水生物学效应研究.辐射防护通讯，1992，4：46-53Zhou Shuai. Radiation Protection Bulletin.1992，4：46-535 Jha AN, Dogra Y, Turner A, et al. Mar Environ Res, 2006;62 Suppl:S297-300.6 Kelsey-Wall A, Seaman JC, Jagoe CH,et al.J Toxicol Environ Health A, 2006，69(3-4):201-137 周舜元. 中华放射医学与防护杂志,1986,6
18、(5):316-319Zhou Shunyuan. Chin J Radiol Med Prot, 1986,6(5)：316 -3198 张伟,吕慧敏,周湘艳.中华放射医学与防护杂志，1997，17 (4)：255-257Zhang Wei,Lv Huimin,Zhou Xiangyan.Chin J Radiol Med Prot, 1997，17 (4) ：255-2579 刘树铮.医学放射生物学.北京：原子能出版社，1998：112-113Liu Shuzheng. Medical Radiobiology.Beijing:Atomic Energy Press,1998:112-11
19、3experimental study of irradiation injury in mice induced by tritium oxideCUI Fengmei1,2 HU Mingjiang1,2 BAO Guangliang3 SUN Liang1,2 WANG Daojin1 TONG Jian1,21(School of Radiation Medicine and Public Health, Suzhou University,Suzhou 215123)2(Jiangsu Provincial Key Laboratory of Radiation Medicine a
20、nd Protection, Suzhou 215123)3 (Shanghai Institute of Applied Physics,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201800)ABSTRACT The work is to detect the total number of white cells in pheriperal blood and the frequencies of micronucleated polychromatic erythrocytes( fMNPCE) in bone marrow in mice after
21、tritium oxide injected. Fourty mature C57BL/6J mice were randomly divided into 8 groups: 1 control group, 2 different initial concentration groups and 5 same initial concentration groups. The mice of different initial concentration groups were injected tritium oxide of 1.85107Bq/ml and 16.65107Bq/ml
22、, then executed in 10th day. The mice of same concentration groups were injected tritium oxide of 5.55107Bq/ml, then executed in 2,4,6,10 and 28th day. The total number of white cells in pheriperal blood and the fMNPCE were detected. Compared with the control group,the total number of white cells of
23、 different initial concentration groups reduced with the accumulative dose increased, while the fMNPCE increased (P0.05). The total number of white cells declined(P0.05) before 6d and recovered(P0.05) till 10d, while the fMNPCE increased(P0.05) continuously till 28d. It shows that the total number o
24、f white cells in pheriperal blood and the fMNPCE in bone marrow may be early sensitive indicators when tritium irradiation.KEYWORDS tritium oxide; mice; white cells in pheriperal blood; polychromatic erythrocytes; micronucleiCLC R818.03, R595.9, R818.74, R994.2, R994.6国家自然科学基金资助（30800922）,放射医学国家重点学科资助（ZY126601）第一作者：崔凤梅，女，1975年10月出生，讲师，2008年于苏州大学获得医学博士学位，主要从事放射毒理学研究通讯作者：童建,教授，
