1、大豆蛋白 glycinin 和 -conglycinin 经口诱发五指山小型猪过敏反应的实验研究黄琼 1 徐海滨* 2 杨杏芬 1 黄俊明 1 于州 2 高芃 2 刘珊 2广东省疾病预防控制中心毒理实验所，广州 510300摘要：目的 建立适用于评价食物中潜在致敏物质的五指山小型猪大豆球蛋白（11S）和 伴球蛋白（7S）经口致敏模型。方法 20 头 1.5 月龄五指山小型猪分别摄入含 0、4 11S、8 11S、4 7S、8 7S 大豆蛋白的饲料，通过胃肠道致敏(0-10d )和反复经口激发(16-18d,31d)诱导致敏反应，从皮肤试敏反应、血清 IgG、IgE 和组胺水平、小肠组胺含量和肥
2、大细胞数量、外周血淋巴细胞亚群和细胞因子表达等方面进行模型评价和可能致敏机制的探讨。结果 接受 11S 或 7S 经口致敏的仔猪皮肤试敏试验呈不同程度的阳性反应；致敏组仔猪血清中 IgG、IgE 抗体和组胺含量在第 19d 即激发期后达到最高，三个时间点仔猪血清中 IgG、IgE 抗体和组胺含量两两呈正相关；实验第 19d 4 11S 和 4 7S 致敏组血清中 IgG、IgE 抗体和组胺含量均高于对照组，第 32d 4 11S 和 4 7S 致敏组 IgE 抗体和 4 11S 致敏组 IgG 抗体和组胺含量均高于对照组；空肠组胺含量与十二指肠组胺、回肠组胺含量呈正相关，而与空肠粘膜层和粘膜下
3、层肥大细胞数呈负相关；4 7S 致敏组空肠组胺高于对照组，4 11S 致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目低于对照组；实验第 19d 4 7S 致敏组血清中 IFN-含量较对照组降低；实验终期 8 11S 致敏组外周血 CD4+/CD8+比值较对照组升高，以上差异比较或相关性检验均有显著性意义（P0.05 或 0.01） 。结论 由大豆蛋白 glycinin 和 -conglycinin 诱发的五指山小型猪食物致敏模型属IgE 介导的型过敏反应类型，可用于食物潜在致敏性的评价。关键词：食物过敏 大豆球蛋白 大豆伴球蛋白 五指山小型猪 Experimental studies of anaphylac
4、tic reactions in WZS minipig orally induced by soybean glycinin and -conglycinin HUANG Qiong, XU Haibin, Yang Xingfen, Huang Junming, Yu Zhou, GAO Peng, Liu ShanInstitute of Toxicology, Center for Disease Control and Prevention of Guangdong Province, Guangzhou 510300, China基金项目：国家科技部 973 计划（No:2007C
5、B109207）* 通讯作者简介：徐海滨，男，研究员，博士生导师，研究方向：食品毒理学，转基因食品安全性评价，E-mail： 1 广东省疾病预防控制中心2 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所Abstract: Objective: To establish glycinin（11S）and -conglycinin（7S） allergy minipig models to evaluate potential allergens in food. Methods: Twenty 1.5 months old WZS minipigs were respectively gastric s
6、ensitized(0-10d) and oral challenged(16-18d,31d) with diets containing 0, 4 11S, 8 11S, 4 7S or 8 7S soybean proteins to induce anaphylactic reactions. Skin prick test, serum IgG，IgE and histamine levels, small intestine histamine concentrations and mast cell numbers, blood lymphocyte sub-sets and c
7、ytokines expressions were measured to evaluate the model and investigate possible mechanisms. Results: Positive skin test responses at different degrees were observed in 11S and 7S sensitized groups. The serum IgG, IgE and histamine levels all reached the peak after 11S or 7S groups were oral challe
8、nged at 19d, and every two of them were significantly and positively correlated（P0.01）. Compared with the control, serum IgG, IgE and histamine levels of 4 11S and 4 7S groups at 19d, serum IgE of 4 11S and 4 7S at 32d, and serum IgG and histamine levels of 4 11S at 32d were all significantly increa
9、sed（P0.05 or 0.01）. The jejunum histamine level was positively correlated with that of the duodenum and ileum, but negatively correlated with the mast cell numbers in the jejunum mucosa and sub-mucosa（P0.01）. Compared with the control, the jejunum histamine level of 4 7S group was increased and the
10、mast cell number in the jejunum sub-mucosa of 4 11S group was decreased（P0.05 or 0.01）.Compared with the control, the serum IFN- content of 4 7S group was significantly decreased, while the CD4+/CD8+ ratio of 8 11S group was significantly increased. Conclusion: The WZS minipig allergy model induced
11、by soybean glycinin and -conglycinin both are type hypersensitivity mediated by IgE, which can be used to predict the potential allergenicity of novel foods. Key words: Food Allergy glycinin -conglycinin WZS minipig食物过敏是指食物引起的一类非毒性不良反应，主要临床表现为皮肤、胃肠道或呼吸道症状，严重者可导致全身系统性过敏症状如休克等甚至死亡。目前估计全世界范围内有3%4%的成年人和
12、6%的儿童患有食物过敏,因此食物过敏已成为国际社会关注的一个食品安全问题1。而且，食物过敏流行趋势仍在继续增长，尤其是在“西方化”社会，原因可能与“卫生假说”和全球范围内食物消费多样性的增加相关2。已知的常见食物致敏原包括大豆、花生、甲壳类动物、鸡蛋、牛奶、鱼、坚果和小麦等。目前对于食物过敏反应的治疗尚无十分有效手段，个体预防性回避接触确认或可疑致敏原仍然是防治关键。除上述传统的八大类食物致敏原外，食物中潜在致敏物质的评价也是预防的关键。随着基因工程技术的迅猛发展，转基因食品的出现不仅带来了新一轮的食品工业革命，同时也掀起了关于其安全性的质疑热潮，关于其潜在致敏性的评价从一开始就是人们关注的热
13、点。1996年Nordlee报道了转入巴西坚果基因后的大豆可诱发对巴西坚果过敏的人发生过敏反应3，此案例在一定程度上促进了致敏性鉴定成为转基因食品安全性评价中必不可少的重要内容。目前，关于转基因食品致敏性评价通常采用综合、逐步及个案分析的原则4，常用的分析方法为1996年国际食品生物技术委员会(IFBC)和国际生命科学学会(ILSI)联合制订的判定树分析法(decision tree approach)5，该方法包括结构分析和氨基酸序列比较；理化特性研究如消化稳定性和热稳定性；蛋白质在食物中的含量及消费模式等。2001年,FAO/WHO在该判定树的基础上进行了发展和完善,主要增加了靶血清筛选试
14、验和动物模型试验内容,并认为食物致敏动物模型是评价其潜在致敏性最直接的方法,再次肯定了开展食物致敏动物模型研究的必要性和意义6。研究至今，食物致敏动物模型主要用于验证过敏性疾病的免疫治疗物质有效性和预测对人类有潜在致敏性的物质两方面。动物种属涵盖啮齿类动物和非啮齿类动物，前者主要是小鼠、大鼠和豚鼠，后者包括狗、猪等。目前国际上尚未建立食物致敏性评价的标准动物模型，实际上任何单一模型不可能适用所有目的，至今也未发现一种可重复23种以上常见食物致敏原在人体引起的过敏反应的动物模型，关键是要根据研究目的和各种模型特点进行针对性地选择7。比如啮齿类动物模型多适用于分子和细胞水平的致敏机制研究，并具有费
15、用少、易获得和易操作的优势。而在进行过敏性疾病研究，如更多关注皮肤、呼吸道和胃肠道等临床症状的改变则可考虑使用大动物如猪和狗等作为模型。近年来，一些非啮齿类大动物如猪和狗等，由于诸多优势逐渐被食物致敏研究者们关注和利用：(1)确认的对天然过敏食物的临床和免疫学表现；(2)与人类更近似的解剖学、生理学和营养需要特点；(3)与人类更近似的免疫病理学、机制学和治疗性干预策略；(4)可反复多次胃肠道内窥镜观察；(5)可获得大量免疫器官或细胞进行研究；(6)可减少单位体重致敏原使用浓度。当然这些大动物研究的一些缺点也是易见的，主要集中在种属与品系的有限性，基因敲除品系尚不可得，免疫方法研究试剂的缺乏，大
16、体积而小样本以及较为昂贵的费用等方面8。与其它动物模型比较，猪在研究致敏原发病机理和免疫应答等方面有许多更重要的优点。除与人类在胃肠道生理学和黏膜免疫发育上的极相似性外，同时由于具有先天免疫反应活性使得利用猪进行免疫反应评价更为有效和可能。目前进行猪的致敏模型研究只在个别实验室开展9-10，利用猪致敏模型筛选转基因食品的潜在致敏性尚未见研究报道。大豆作为一种优质植物性蛋白原料，已被广泛应用食品和动物饲料生产中，但由于其含有的多种抗营养成分影响了其进一步的开发和利用。大豆抗原蛋白是大豆中最主要的抗营养因子，而大豆球蛋白（glycinin）和 -伴球蛋白（-conglycinin）是两种免疫原性最
17、强的大豆抗原蛋白，诸多研究对两者的免疫血特性和致敏性作了广泛研究，现已明确这两种蛋白是引起动物大豆过敏反应的主要物质11。本研究以我国自主驯化和成功培育的实验用近交系五指山小型猪作为模式动物，采用大豆抗原蛋白 glycinin 和-conglycinin 作为阳性致敏物，建立适用于评价食物中潜在致敏物质致敏性的大动物模型，旨在为我国建立转基因食品致敏性的评价程序提供一定理论依据和实验参考。1 材料与方法1.1 大豆抗原蛋白纯化的大豆提取物 glycinin（以下简称 11S）和-conglycinin （以下简称 7S）蛋白由中国农业大学食品科技学院郭顺堂教授惠赠（专利号为：No 200410
18、029589.4） ，冷冻干燥磨粉后 4冷藏保存，经 SDS-PAGE 电泳和考马斯亮兰染色后分析，纯度分别为 85和 80。1.2 动物和饲料20 头（4 窝5 头）五指山小型猪仔猪由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供，仔猪 30d 时开始逐步进食无大豆配方饲料，45d 完全断乳进入全封闭式猪舍，舍温 2628，相对湿度为 5060，昼夜光照交替时间为 12/12h，送排风为集中自动控制，仔猪单笼（70cm60cm）饲养，不锈钢可拆洗式料槽，自由饮水，每日按体重 3分两次（8:00 am/16:00 pm）给予无大豆配方饲料，适应 4d 后进入实验。无大豆配方饲料参照 NRC（1998）配
19、制，为玉米脱脂奶粉酪蛋白型半纯和日粮，配方和营养成分分析结果（由中国农业大学饲料分析测试中心检测）见表 1。表 1 玉米脱脂奶粉酪蛋白型半纯和猪饲料和营养成分分析结果配方组成 含量（）玉米粉 60.2脱脂奶粉 9.5乳清粉 10.0酪蛋白 11.6猪血浆喷雾蛋白粉 3.0鱼粉 3.0石灰 0.5磷酸氢钙 1.0食盐 0.2预混料（仔猪用） 1 1.0合计 100营养成分化学分析（测定值）粗蛋白 21.42钙 1.11磷 0.75赖氨酸 1.64能量 (MJ/Kg) 13.801 预混料为每千克饲料中含：维生素 A, 10,000IU; 维生素 D3, 1,500IU; 维生素 E, 30IU;
20、 维生素 K3, 2.5mg; 维生素 B1, 1.5mg; 维生素 B2, 10mg; 维生素 B6, 10mg; 维生素 B12, 0.05mg; 叶酸, 1.0mg; 维生素 B7, 0.5mg; 维生素 B5, 30mg; 泛酸, 20mg; 铜, 20mg; 铁, 100mg; 锌, 110mg; 锰, 40mg; 硒, 0.3mg; 碘, 0.5mg;1.3 主要仪器设备和试剂离心机（Beckman） ，称重仪（ HUAPU,XK3119L） ，天平（ Sartorius BS423S） ，流式细胞仪（BD Biosciences FACS Calibur） ，酶标仪（Sun ri
21、se） ，电动组织分散仪（PRO 200） ，封片机、切片机、包埋机（SAKURA） ，染片机（ Leica） ，显微镜用测微尺（上海珊科仪器厂） ，多聚赖氨酸玻片（Corning ）舒泰 100（Virbac） ，酸性土豆磷酸酶（Sigma-aldrich） ，组胺（Sigma-aldrich） ，甲苯胺蓝（Amresco ） ，猪淋巴细胞分离液（天津灏洋，TBD） ，小鼠抗猪 PE-CD8a IgG2a、小鼠抗猪 PE-CD4a IgG2b、小鼠抗猪FITC-CD3 IgG2a（BD Biosciences Pharmingen） 。1.4 试验设计按照体重将 20 头仔猪随机分至五组，分
22、别为对照组，4 11S，8 11S，4 7S 和 8 7S 致敏组。四个试验组仔猪在进入实验的第 010d（致敏期）和 1618d（激发期）分别进食将大豆抗原 11S 和 7S蛋白按每日总饲料量的 4或 8比例均匀拌入的无大豆配方饲料，对照组饲喂无大豆配方饲料；各组仔猪在实验第 11d 和 19d 分别中期采血一次，实验第 25d 进行皮肤试敏试验；在实验第 31d（16:00 pm） ，致敏组分别饲喂 4或 8 glycinin 和-conglycinin 蛋白进行末次激发，实验第 32d（8:00 am）进行终期采血、麻醉、放血处死和解剖取材。1.5 样本采集和麻醉解剖中期采血：实验第 1
23、1d、19d 仔猪保定后，经颈静脉丛采取 45ml 非抗凝血，室温静置 2h 后分离血清（2500rpm，20min） ，分装后-80冻存。终期采血：仔猪保定后，经颈静脉丛采取 45ml 非抗凝血和 34ml 枸橼酸钠抗凝血，前者室温放置 2h 后分离血清（2500rpm，20min） ，分装后-80冻存；后者用猪淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞后-80 冻存。麻醉：进行皮肤试敏试验和终期解剖时采用 0.05ml/kg 舒泰 100 耳后肌注诱导麻醉，浓度根据动物麻醉后反应程度进行适度调整。终期解剖：仔猪麻醉后经心脏放血处死后，剖开腹腔，游离胃肠组织，取十二指肠、空肠、回肠（近回盲褶 34
24、cm 处）各 1cm，放入 Caronys 固定液（无水乙醇: 氯仿:冰醋酸6:3:1 ）中固定，用于肥大细胞组织化学染色；另取各肠段 12cm，用生理盐水灌注冲洗后，滤纸吸干水份，立即放入液氮中保存，用于肠道组织中组胺含量的测定。1.6 一般情况观察（腹泻、体重和饲料摄食情况）仔猪进入试验后，第 0,7,14,21,28,31d 清晨空腹称重，计算仔猪饲料利用率，观察并记录试验全期各组仔猪的活动和腹泻情况。1.7 皮试试验第 25d 进行皮肤试敏试验。各组仔猪按体重比例给予舒泰 100 麻醉后，针刺测试麻醉程度，无明显反应后，仰卧位保定，暴露腹部白色皮肤，用动物专用剃毛剪小心备皮，油性记号笔
25、划出皮试范围并分区标记，分别在相应区域皮内注射 0.1ml PBS，PAP ，组胺，包被液（抗原蛋白溶剂） ，11S，7S 溶液（考马斯亮兰法定蛋白含量约 1mg） ，在注射后 30min 内，观察并测量各点皮肤上的红斑直径，若其大于5mm，可认为皮肤过敏反应阳性。1.8 血清 IgG 和 IgE 抗体分析血清总 IgG 和 IgE 抗体含量采用猪 IgG 和 IgE ELISA 试剂盒（RapidBio Lab, Calabasas,CA,USA ）分析。1.9 血清和肠组织组胺含量分析血清组胺含量采用猪血清组胺 ELISA 试剂盒（RapidBio Lab, Calabasas,CA,US
26、A）分析；肠组织组胺含量采用猪组织组胺 ELISA 试剂盒（RapidBio Lab, Calabasas,CA,USA）分析。肠组织匀浆制备：准确称取 0.40.5g 小肠组织，至 10ml 离心管中剪碎，加入 5 倍体积 PBS 溶液，在电动组织分散仪上冰浴匀浆，然后 4，10,000rpm 离心 10min，取上清液-20保存次日分析。1.10 血清 Th1/Th2 细胞因子含量分析血清中 Th1（IL-2，IFN-）/Th2（IL-4 ，IL-10）细胞因子含量采用猪 IL-2，IFN- ，IL-4，IL-10 ELISA 试剂盒（Biosource, Camarillo,CA,USA
27、 ）进行分析。1.11 外周血淋巴细胞亚群（CD3/CD4/CD8）的表达分析外周血淋巴细胞亚群（CD3/CD4/CD8）的表达采用流式细胞仪 (FACS Calibur, BD, USA)进行CD4 /CD3 和 CD8 /CD3 比例分析，小鼠抗猪 CD8a 和 CD4a 均为 PE 标记，小鼠抗猪 CD3为 FITC 标记。终期解剖后取抗凝外周血分离出单个核细胞（PBMC）后，-80 保存，集中分析前解冻，计数，染色标记，避光 4 孵育 30min 后，冷 PBS 洗涤 1 次（250g,5min）后上机分析。1.12 肠组织肥大细胞计数12肠组织肥大细胞组织化学特殊染色：Caronys
28、 固定液中固定后的肠组织进行常规取材、包埋、切片，选择经多聚赖氨酸处理的载玻片制片，常规脱腊、止水后进行甲苯胺蓝染色（0.5，30min ） ，0.5冰醋酸分化数秒，冷风吹干，二甲苯透明，中性树脂封片。肥大细胞计数：每张片子各随机选取 10 处肠绒毛黏膜和黏膜下层，显微镜下 200放大观察，经物镜测微尺校正，利用网型目镜测微尺（0.25mm 2/分格，100 分格） ，分别计数每平方毫米肥大细胞数目。1.13 统计分析所有数据采用 SPSS11.0 进行单因素方差分析(One-way ANOVA test)、非参数检验(Mann-Whitney test)和双变量相关分析（Bivariate
29、correlation test） 。2 结果2.1 一般情况观察（腹泻、体重和饲料摄食情况）与对照组比较，大豆抗原蛋白致敏组体重和饲料利用率有下降趋势（结果未显示） ，但差异比较无统计学意义。少数致敏组仔猪出现轻度腹泻症状。2.2 皮肤试敏试验结果皮肤试敏试验结果见图 1 所示，皮试 15min 后，对照组仔猪皮肤（ C）除组胺点出现红斑外，其余各点均无明显反应；4% 11S 致敏组仔猪皮肤（B）和 4% 7S 致敏组仔猪皮肤（A）在 11S 和 7S 点红斑反应较其余对照点重，而较组胺点轻。结果表明未接受 11S 或 7S 经口致敏的仔猪，皮肤试敏试验呈阴性反应，而接受 11S 或 7S
30、经口致敏的仔猪皮肤试敏试验呈不同程度的阳性反应（未全部图示） 。A：4 7S 致敏组 B：4 11S 致敏组1. PBS:磷酸盐缓冲液 阴性对照2. PAP:土豆碱性磷酸酶 阴性蛋白对照3. HIS:组胺 阳性对照4. CA:包被液 溶剂对照5. 11S: conglycinin6. 7S: glycininC：阴性对照组 图 1 glycinin 和 conglycinin 诱发仔猪皮肤过敏反应结果2.3 血清 IgG 和 IgE 抗体和组胺含量分析不同采血时间点（11d、19d、32d）仔猪血清中 IgG、IgE 抗体和组胺含量见图 2，表 34 所示。从表 2 可见，第 19d 4 11
31、S 和 47S 致敏组血清中 IgG、IgE 抗体和组胺含量（对数转换值）均高于对照组，第 32d 411S 和 4 7S 致敏组 IgE 抗体和 4 11S 致敏组 IgG 抗体和组胺含量（对数转换值）均高于对照组，差异比较有显著性意义（P0.05 或 0.01） ；从表 3 可见，三个时间点仔猪血清中 IgG、IgE抗体和组胺含量两两呈正相关，相关性检验有显著性意义（P0.01 ） ；从图 2 可见，三个时间点仔猪血清中 IgG、IgE 抗体和组胺含量在第 19d 即激发期后达到最高，且此点仔猪血清中 IgG、IgE 抗体和组胺含量从高到低依次为 4 7S、4 11S、8% 7S、8% 1
32、1S 致敏组和对照组。图 2 不同时间仔猪血清中总 IgG(A)、IgE(B)和组胺(C)水平表 2 不同时间仔猪血清 IgG、IgE 抗体和组胺含量比较（对数转换值）Log10IgG Log10IgE Log10HistamineGroup11d 19d 32d 11d 19d 32d 11d 19d 32dcontrol 2.190.16 2.290.25 2.170.12 1.650.14 1.770.23 1.640.07 1.330.14 1.450.23 1.310.074% 11S 2.430.54 2.910.21a 2.610.12a 1.890.51 2.380.18a 2
33、.130.17a 1.570.51 2.060.18a 1.810.18a8% 11S 2.340.17 2.450.45 2.160.39 1.790.17 1.930.41 1.640.39 1.470.17 1.610.41 1.320.394% 7S 2.140.36 2.950.31a 2.490.14 1.650.30 2.450.30b 2.010.13a 1.330.30 2.130.30b 1.680.128% 7S 2.400.15 2.610.32 2.390.29 1.960.15 2.190.33 1.900.32 1.640.15 1.870.33 1.580.32
34、One-way ANOVA：与对照组比较 a: P0.05 b: P0.01；n=411d 19d 32d 11d 19d 32d 11d 19d 32dA B C表 3 不同时间仔猪血清 IgG、IgE 抗体和组胺含量的 Pearson 相关分析表（n20）Serum IgE Serum HistamineFactor11d 19d 32d 11d 19d 32d11d 0.9581* 0.167 0.049 0.958* 0.167 0.04919d 0.175 0.888* 0.344 0.175 0.888* 0.344Serum IgG32d 0.119 0.364 0.771* 0
35、.119 0.364 0.771*11d 1 0.194 -0.052 1.000* 0.194 -0.05319d 0.194 1 0.222 0.194 1.000* 0.222Serum IgE32d -0.052 0.222 1 -0.052 0.222 1.000*1 Pearson Correlation Coefficients* Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).2.4 肠组织组胺含量分析和肥大细胞计数终期解剖后仔猪肠组织十二指肠、空肠和回肠组胺含量及粘膜层和粘膜下层肥大细胞数结果见表45。从表 4
36、可见，4 7S 致敏组空肠组胺高于对照组， 4 11S 致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目低于对照组，差异比较有显著性意义（P0.05 或 0.01） ；从表 5 可见，空肠组胺含量与十二指肠组胺、回肠组胺含量呈正相关，而与空肠粘膜层和粘膜下层肥大细胞数呈负相关，相关性均有显著性意义（P0.01） 。表 4 仔猪肠组织组胺含量及粘膜和粘膜下层肥大细胞数Intestine Histamine(ng/g) Mast cell numbers in the mucosa(numbers/0.04mm2)Mast cell numbers in the submucosa(numbers/0.04mm2)
37、GroupDuodenum Jejunum Ileum Duodenum Jejunum Ileum Duodenum Jejunum Ileumcontrol 116.05 74.61 83.16 9.0 13.3 13.8 12.1 13.1 13.04% 11S 129.87 145.66 101.58 5.5 9.0 8.4 8.8 6.8a 7.18% 11S 110.13 110.13 73.95 9.3 9.8 10.7 10.8 10.9 9.04% 7S 206.18 221.32b 146.32 8.5 8.6 12.4 12.8 11.0 11.78% 7S 99.61
38、66.05 43.69 10.0 15.1 13.0 11.5 14.2 11.2SEM 18.83 17.65 15.97 0.8 1.0 0.9 0.7 0.8 1.0SEM 平均数标准误 (Standard error of the mean)Mann-Whitney Test：与对照组比较 a: P0.05 b: P0.01；n=4表 5 空肠组胺含量与十二指肠组胺、回肠组胺含量及空肠肥大细胞数 Pearson 相关分析表（n=20）Factor Duodenum histamine Ileum histamine Mast cell numbers in the Jejunum mu
39、cosaMast cell numbers in the Jejunum submucosaR P value R P value R P value R P valueJejunum histamine 0.630 0.003* 0.682 0.001* -0.735 0.000* -0.622 0.003*R: Correlation Coefficients* Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).2.5 血清 Th1/Th2（IL-2，IFN-，IL-4，IL-10）细胞因子含量分析仔猪血清中 Th1/Th2（I
40、L-2，IFN-，IL-4，IL-10）细胞因子含量 除 IFN-含量稍高外，其余细胞因子含量均较低，IFN-分析结果见表 67。从表 6 可见，实验第 19d 47S 致敏组血清中 IFN-含量较对照组较低，差异比较有显著性意义（P0.05） ；从表 7 可见，实验第 11d 血清中 IFN-含量与十二指肠组胺水平呈负相关，而实验第 19d 血清中 IFN-含量与空肠和回肠组胺水平呈负相关，相关性检验有显著性意义（P0.05 或 0.01） 。表 6 Glycinin 和 -conglycinin 对仔猪血清 IFN-表达的影响IFN-（pg/ml）Group11d 19d 32dcontr
41、ol 39.538.27 51.109.67 38.4410.314% 11S 38.135.34 44.778.30 39.147.008% 11S 41.1013.59 55.739.97 37.117.154% 7S 29.593.43 35.786.42a 36.338.188% 7S 42.118.54 54.6111.20 39.068.63One-way ANOVA：与对照组比较 a: P0.05；n=4表 7 仔猪血清 IFN-表达水平与小肠组胺含量的 Pearson 相关分析表（n=20）Factor Duodenum histamine level Jejunum hist
42、amine level Ileum histamine levelIFN- R P value R P value R P value11d -0.473 0.047* -0.376 0.124 -0.372 0.12919d -0.436 0.062 -0.674 0.002* -0.563 0.012*32d -0.242 0.304 -0.236 0.316 -0.321 0.168R: Correlation Coefficients* Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).* Correlation is si
43、gnificant at the 0.01 level (2-tailed).2.6 仔猪外周血淋巴细胞亚群（CD3/CD4/CD8）的表达分析终期解剖后仔猪外周血淋巴细胞亚群（CD3/CD4/CD8）的表达见表 8，8 11S 致敏组 CD3+/CD4+ 比例较对照组升高，CD3 +/CD8+比例较对照组降低，而 CD4+/CD8+比值较对照组升高，差异比较有显著性意义（P0.05） 。表 8 Glycinin 和 -conglycinin 对仔猪外周血淋巴细胞亚群的影响Group CD3+/CD4+(%) CD3+/CD8+(%) CD4+/CD8+control 4.03 1.39 39
44、.26 1.72 0.10 0.048% 11S 7.30 0.85* 31.59 9.88* 0.25 0.09*8% 7S 6.35 2.02 35.12 3.88 0.18 0.04Mann-Whitney Test：* 与对照组比较 P0.05，n43 讨论小型猪属珍稀猪种，原产地主要在中国和越南，在分类学上与普通家猪相同，但由于其体型和个体差异小、发育慢、培育遗传背景一致等优点已发展为适合于科学研究用的实验用猪。美国早在上世纪 40年代就开始了小型猪的培育开发研究，到 80 年代美国、德国和日本等国家先后培育出各自的小型猪品系，并广泛应用于生物科学研究。我国小型猪品种资源丰富，具有独
45、特的优质小型猪资源。上世纪 80 年代初至今，国内成功培育开发和实验动物化的品系主要有版纳微型猪、贵州小型香猪、巴马小型猪、五指山小型猪和西藏小型猪，经过选育的小型猪已初步应用于皮肤烧伤、肿瘤学、心血管疾病、遗传和营养型疾病、器官移植、疫苗研制等生命科学研究领域13。本研究采用的近交系五指山小型猪是国内较早驯化和培育的小型猪品种，近交系数高达 0.979，且遗传稳定，基因高度纯合，个体间差异小14，是开展食物致敏模型研究的理想小型猪品系。本研究通过经口给予五指山小型猪仔猪大豆抗原蛋白 glycinin 和-conglycinin，诱发其产生过敏反应，从皮肤试敏反应、免疫球蛋白水平、组胺含量、肥
46、大细胞数量、淋巴细胞亚群和细胞因子表达等方面进行评价分析和作用机制探讨，旨在建立适用于评价食物中潜在致敏物质的食物致敏模型。由于IgE和组胺在IgE介导的型过敏反应中的重要作用，目前几乎已成为评价食物致敏动物模型成功与否的标志性指标15-16。从本研究仔猪皮肤试敏试验、血清免疫球蛋白和组胺含量结果分析，尤其是血清IgG、IgE抗体及组胺含量在各个体各时间点的强相关性均表明所建立的大豆抗原蛋白glycinin和-conglycinin诱发五指山小型猪食物致敏模型是成立的，-conglycinin较glycinin致敏性更强，可能与大豆中最主要的三种致敏原都存在于-conglycinin组分有关1
47、7，但两者4剂量均较8剂量过敏反应表现明显，并不呈剂量反应关系，分析原因可能与食物致敏的特点有关，是否与大剂量抗原诱发口服免疫耐受有关也值得进一步的探讨。从实验第11d、19d、32d的动态观察结果分析，第19d即激发期后是仔猪过敏反应最强期，可作为模型的最佳观察时点。肥大细胞是存在于胃肠道黏膜层和黏膜下层的一种免疫活性细胞，在一定条件下可以活化脱颗粒。本研究采用甲苯胺蓝作为肥大细胞的特异性染料，使其胞浆颗粒染紫红色，结果显示空肠组胺含量与十二指肠组胺、回肠组胺含量呈正相关，而与空肠粘膜层和粘膜下层肥大细胞数呈负相关，相关性均有显著性意义，该结果与诸多研究结果一致18，小肠内完整肥大细胞数目与
48、组胺含量呈负相关，即完整肥大细胞数量少，组胺含量高，其原因可能是肥大细胞增殖活化脱颗粒后，导致释放的组胺增多。仔猪肠组织十二指肠、空肠和回肠组胺含量分析结果显示，4 7S 和 4 11S 致敏组肠道组胺含量均高于对照组，而肥大细胞数均低于对照组，其中 4 7S 致敏组空肠组胺含量和 4 11S 致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目与对照组比较，差异有显著性意义，该结果与 Rciki M Helm 建立的花生致敏模型表现一致9，即经食物致敏原致敏后小肠组织中完整肥大细胞数目减少，炎性介质组胺释放增加，从而诱发肠道的炎性反应，但本实验中分析小肠组胺含量和肥大细胞数目的组织取材来自致敏第 32d，而非第 19d 强致敏反应表现期的仔猪小肠，结合血清免疫球蛋白和组胺的结果，选择第 19d 即激发期后作为模型观察终点可能更为合理和敏感。目前认为 B 细胞诱导产生特异性 IgE 抗体过程中，两种信号的介导起到关键作用，其一是致敏原的B 细胞抗原簇要特异性结合 B 细胞受体，其二是致敏原的 T 细胞抗原簇
