1、1天然药物化学实验指导（供药学及药学相关专业使用）主 编： 马宁主 审： 朱绍雄副主编： 魏丹丹 李娟参 编： 王建芬 徐芳 肖志勇 李媛肖海英 肖艳 刘卫平 李云贵吴柱 刘明长沙医学院药物化学教研室二 O 一 O 年六月2前 言天然药物化学实验指导是依据天然药物化学 （第五版）理论教材，结合我院四年制本科药学专业学生的培养目标、实验教学大纲以及实验教学的实际情况，由药物化学教研室整理编写而成。本教材主要目的是通过实验教学，使学生对理论知识的理解更加深入，掌握得更加牢固，通过实际操作加强对学生基本操作技能的训练，培养学生的动手能力，和分析问题解决问题的能力，使学生从中获得从事天然药物化学科研与
2、生产实践活动的能力。根据教学以及学生实际能力等方面的需要，本指导在原版教材基础上增加了验证性实验 、综合性实验和设计性实验，切实提高实验教学的质量。本教材共分两部分，第一部分介绍了天然药物化学实验技术，着重讲述了天然药物活性成分提取、分离和结构鉴定的原理和操作方法。第二部分是实验部分，共十二个实验，实验内容包括苯丙素类、醌类、黄酮类、萜类、挥发油和生物碱等主要天然产物类别代表药物的提取、分离，鉴别原理和实验操作，其中新增了设计性和综合性实验相结合的挥发油提取分离实验；新增绞股蓝总皂苷的提取分离和鉴别实验的设计性实验；新增薄层板的制备活度测定及应用、秦皮中有效成分的提取分离和鉴别、穿心莲内酯的提
3、取分离鉴定、薯蓣皂苷元的提取分离鉴别等验证性和综合性实验。本教材的内容丰富，重点突出，实用性强，能满足四年制药学本科的实验教学，并且书后附有天然药物化学常用试剂、配制方法和常用有机溶媒的性质与回收方法，以方便读者查阅。由于编者水平有限，编写时间仓促，书中难免有不妥之处，敬请使用本实验指导的老师和同学批评指正。编 者2010 年 6 月3目 录实验须知1第一章 天然药物化学实验技术5第一节 经典的提取和分离方法5第二节 结晶和重结晶9第三节 层析分离方法11第二章 实验部分18实验一 中草药化学成分的鉴别法18实验二 薄层板的制备、活度测定及应用25实验三 秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取分离和鉴别
4、28实验四 虎杖中游离羟基蒽醌类成分的提取分离和鉴别31实验五 芦丁的提取分离和鉴别36实验六 黄芩中黄芩苷的提取分离和鉴别40实验七 挥发油成分的提取和鉴别44实验八 穿心莲内酯的提取分离鉴别与亚硫酸氢钠加成物的制备48实验九 女贞子中齐墩果酸的提取分离和鉴别54实验十 薯蓣皂苷元的提取分离和鉴别57实验十一 粉防己生物碱的提取分离和鉴别60实验十二 绞股蓝总皂苷的提取分离和鉴别(设计性实验) 65附录一 中草药化学成分检出试剂配制法67附录二 常用有机溶媒的性质74- 1 -实验须知一、天然药物化学实验的特点1实验周期长。本实验指导中一般一个提取分离和鉴别实验需要用去 8 学时，时间长。因
5、此，在实验过程中，应该注意仪器、试剂尤其是提取物的妥善保管或者保存。2所用试剂和溶剂品种较多，用量较大，许多试剂易燃、有毒或有腐蚀性，在一定条件下可能会和空气会形成爆炸混合物。许多实验需用电炉加热或进行减压操作，学生用到的热源和电器较多，因此应切实注意实验安全，严防产生触电、中毒、烫伤等意外发生，谨防发生火灾、爆炸等重大事故，并保证实验室通风良好。二、实验规则天然药物化学实验教学是天然药物化学课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然药物有效成分提取、分离和鉴定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力。养成严谨的科学态度和良好的工作作风是必不可少的教学环节。为此，提出下列实验注
6、意事项：1遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生，若发生事故应立即报告指导教师，进行适当处理。2实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天计划，争取准时结束。实验过程应养成及时记录的习惯，凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录，实验完毕后，认真总结，写好实验报告，将提取分离纯化所得单体产物包好，贴上标签（日期、样品名称、mp、重量）交给老师。3实验中保持安静，不许大声喧闹，不许抽烟、无故迟到和随便离开。实验台面应保持清洁，使用过的仪器及时清洗干净，存放在实验柜内，废弃的固体和滤纸等丢入废
7、物缸内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞下水道和影响环境卫生。4公用仪器、试剂和药品用完后立即放回原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。节约用水、用电和药品试剂。5保持实验室内整洁，学生采取轮流值日，每次实验完毕，值日生负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，检查水、电和门窗是否关闭。三、实验安全须知在天然药物化学实验中，常使用甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙醚、石油醚等易挥发、易燃、有毒的有机溶剂及易碎的玻璃仪器，若操作不慎，很容易发生事故，常见事故有“火灾”、“爆炸”、“外伤”、“中毒”等，为防止事故的发生，必须随时注意以下几点：1实验开始前应检查仪器是否完整无损，装置是否
8、符合要求。回流、蒸馏时，冷凝水是否通畅，干燥管是否阻塞。若在常压下进行蒸馏或回流，仪器装置必须与大气相通，不能密闭（如密闭加热而导致的容器内压力增加，会引起装置爆裂，特别是使用明火时，装置中的可燃液体就- 2 -会着火）。2回流或蒸馏低沸点易燃液体时，瓶内的液体体积只能装三分之二，不能使用明火加热，最好使用水浴或电热套。液体内要放几颗沸石或素烧瓷片，防止过热暴沸冲料。若在加热后发现未加入沸石，绝不能立即揭开瓶盖补放，而应停止加热，待液体冷却后才能加入，加热途中也不得加入活性炭脱色，否则也会发生暴沸。减压蒸馏使用玻璃仪器，质量要好，最好用圆底烧瓶，防止因机械强度不够，引起爆炸。3蒸馏、回流易燃，
9、易挥发，有毒液体时，仪器装置不能漏气，冷凝管流出液应用弯接管导至接受瓶中，尾气应用橡皮管通往室外或水槽里。4加压柱层析时, 层析柱及储液瓶机械性能要高、连接处要牢，并注意控制压力，以防装置炸裂。5使用电气设备（如电烘箱、电冰箱、真空泵、离心机等）及各种分析仪器时一定要弄清电路及操作规程，严格按照操作规程进行操作。实验室一旦发生火灾事故时，应保持镇静，切勿惊慌失措，应立即采取各种相应措施，以减少事故损失。首先，要立即断绝火源（如电源、煤油炉、煤气等 ）,并移开附近的易燃物质。少量溶剂（几mL）着火，可任其烧完。三角瓶内溶剂着火可用石棉网或湿布盖熄。小火可用湿布或黄沙盖熄，火较大时应根据具体情况采
10、用下列灭火器材。泡沫灭火器：内部分别装有碳酸氢钠溶液和硫酸铝溶液，使用时将筒颠倒，两种溶液立即反应生成硫酸氢钠、氢氧化铝及大量的二氧化碳。灭火器筒内压力突然增大 ，大量二氧化碳泡沫喷出，即可灭火。四氯化碳灭火器：用以扑灭电器或电器附近之火，但不能在狭小和通风不良的实验室中应用，因为四氯化碳在高温时要生成剧毒的光气，此外，四氯化碳和金属钠混合也发生爆炸。使用时须连续抽动唧筒，四氯化碳即会由喷咀喷出，遇热变为气体，此气体比重比空气大 ，能沉下来把火焰包围住，将火扑灭。二氧化碳灭火器：是实验室中最常用的一种灭火器，它的钢瓶内装有压缩的液态二氧化碳，使用时打开开关，二氧化碳气体即会喷出，用以扑灭有机物
11、及电器设备的着火，使用时应注意：一手提灭火器，一手应握在喷二氧化碳喇叭筒的把手上（因喷出的二氧化碳压力骤然降低 ，温度也骤降，手若把在喇叭筒上易被冻伤）。无论用何种灭火器，皆应从火的四周开始向中心扑灭。油浴和有机溶剂着火时绝不能用水浇，这样反而会使火焰蔓延开来。若衣服着火，切勿奔跑，赶快脱下衣服或用厚的外衣包裹致熄。较严重者应躺在地上（以免火焰烧向头部）用防火毯紧紧包住，直至火熄，或打开附近的自来水开关用水冲淋熄 灭。四、试剂的使用- 3 -根据我们国家的标准，按试剂所含杂质的多少，将试剂分成优级纯、分析纯、化学纯、实验试剂四级。优级纯杂质含量最少，又称保证试剂（符号 GR）为一级品，适用于精
12、密的分析工作和科研工作。分析纯的杂质比优级纯稍多，又称分析试剂（符号 AR）为二级品，适用一般的分析工作、分离鉴定工作和科研工作。化学纯（符号 CP）杂质较多，为三级品，适用一般的提取、分离工作及学生实验的一般工作。实验试剂（符号 LR）杂质多，为四级品，用作粗提工作和实验中的辅助试剂。除这四个等级之外，对于专用试剂还有光谱纯试剂，基准试剂、色谱纯试剂等。光谱纯试剂（符号 SP）杂质含量用光谱法已测不出或者杂质的含量低于某一限度，这种试剂主要用来作为光谱分析中的标准物质。基准试剂的纯度相当于或高于保证试剂，用来配制标准溶液，作为容量分析中基准物。色谱纯试剂用来作为色谱分析中展开剂。按照我国化工
13、部标准规定，我国优级纯试剂用绿色标签作为标记；分析纯用红色标签；化学纯用蓝色标签。在天然药物化学提取分离鉴定实验中，要注意选择纯度相当的试剂，能用低纯度的试剂，绝不要用高纯度试剂，高纯度试剂的制备是复杂的，它们的价格昂贵，要克服任何情况下都采用高纯度试剂的不良习惯。另外如用高纯度试剂，实验用的水、操作器皿也要配合。若选用 GR 级试剂要用重蒸馏水，所用器皿不能有任何杂质自器皿上溶解到溶液中。在使用化学试剂时除了解它的纯度外，必须了解它的物理性能，试剂的物理性能主要指熔点（mp）、沸点（bp）、比重（d）、折光率（n）、溶解度、易燃性、毒性及外形等数据。这些特性一般在试剂的标签上都有注明。使用试
14、剂的注意事项如下：1使用易燃、易爆、有毒的试剂时，要特别注意安全，每次按需要量从原包装容器中取出（固体试剂）或倾出（液体试剂）。试剂称量必须在清洁而干燥的器皿内进行。所取的试剂若有剩余，不得倒回原包装容器内，可放入适当带盖的小容器中，并用标签注明。2取固体试剂应使用玻璃、瓷或不锈钢药铲，严禁用刀子或钢铲取强碱性或酸性试剂。取液体试剂用清洁干燥的移液管或玻璃滴管，需要长时期使用若干液体试剂，最好每种试剂有专用移液管。取有毒液体或浓酸、浓碱时，绝不许用移液管以口吸的方式取出，应利用洗耳球吸取或带有橡皮吸球的移液管吸取或利用量筒。在开启试剂的瓶塞之后，应将塞子放于清洁的地方或倒放。3使用有毒物质、易
15、挥发的有毒液体，以及易挥发的强酸、氨等，应在通风橱内进行，应戴有护目镜及橡皮手套。存放这类试剂时，应远离火源，并保存于专用的毒品柜中。4易吸水的试剂，不得开口存放，取出试剂后，应立即盖好塞子，必要时用石蜡熔封。见光发生变化的试剂应放棕色瓶内，置于暗处。在空气中能自燃的试剂应保存在盛有适当液体的密闭容器中（如金属钠、钾放煤油中，黄磷放水中）。五、急救常识- 4 -1玻璃割伤玻璃割伤是常见的事故，如为一般轻伤，应及时挤出污血，用消毒过的镊子取出玻璃碎片，用蒸馏水洗涤伤口，涂上红药水和碘酒后包扎好。如为大伤口，应立即用绷带扎紧伤口上部，使伤口停止出血，急送医院。2火伤轻伤涂甘油、硼酸或凡士林，重伤送
16、医院。3试剂灼伤酸液特别是浓硫酸等浓酸液溅在皮肤上时先应用干布如实验服等尽量擦去酸液后，再用稀碱液或大量水冲洗，以免严重灼伤；若为碱液灼伤，先用大量水冲洗，再用1%醋酸洗，最后用水洗，再涂上油膏或凡士林。酸液或碱液溅入眼睛中时，抹去溅在眼睛外面的酸液或碱液，立即用大量水冲洗。若为酸液，再用1%碳酸氢钠溶液冲洗；若为碱液，再用1%硼酸溶液冲洗，最后用水冲洗，滴入蓖麻油。酸液或碱液洒在衣服上，先用水冲洗。若为酸液再用稀氨水洗。若为碱液，再用1%醋酸溶液洗涤，然后用氢氧化铵中和多余的醋酸，最后用水洗涤。酸液洒在地板上，先撒石灰粉，再用水冲洗。上述各种急救法，仅为暂时减轻疼痛的措施。若伤势过重，在急救
17、之后应速送医院救治。六、实验报告格式天然药物化学实验报告的格式不是固定不变的，可以按题目的内容及要求作适当的调整。除标明实验时间外，一般还包括下列内容：1题目2实验目的3药材中主要成分介绍4实验原理提取分离及鉴定原理。5实验内容操作以流程图表示，简明扼要，包括现象纪录。鉴定包括化学鉴别反应的试剂、现象及结论，色谱鉴定条件，结果及结论。产品产品颜色、晶形、重量、熔点及收率（%）。讨论包括实验过程中主要注意事项、关键步骤、实验成败的原因及心得体会。6思考题可以根据老师的要求，回答各实验中的某些思考题。实验报告要求字迹端正，图表清楚，叙述有条理；尽量做到既有观察的实验现象，又有说明和解释；既有实验数
18、据又有分析和讨论：既有成败的经验教训又有自己的实践体会，甚至有改进的建议。- 5 -第一章 天然药物化学实验技术第一节 经典的提取和分离方法一、溶剂法（一）基本概念溶剂提取法是根据中草药中各种成分在不同溶剂中溶解性不同，即“相似者相溶的原理”，通过选择适当溶剂将中药中的化学成分从药材中提取出来。有机化合物分子中，有的亲水性基团多，极性大而亲水性强；有的亲水性基团少，极性小而亲脂性强，这种亲水性和亲脂性的程度大小与化合物的分子结构直接相关。一般来说，基本母核相同的两种成分，其分子中官能团的极性越大或极性官能团数量越多，则整个分子的极性就越大，表现亲水性越强，而亲脂性就越弱；其分子中非极性部分越大
19、或碳链越长，则极性越小，亲脂性越强，而亲水性就越弱。各类溶剂的性质，同样与其分子结构有关。常用的甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂，它们的分子比较小，并存在羟基，与水分子的结构近似，可和水任意混合。丁醇和戊醇分子中虽亦有羟基，但分子中的碳键逐渐加多，与水性质也就逐渐疏远，所以它们彼此仅能部分互溶，在它们互溶达到饱和状态后，两者都能与水分层。三氯甲烷、苯、石油醚是烃类或氯烃衍生物，属于亲脂性强的溶剂。常见溶剂的极性度强弱顺序可表示如下：石油醚（低沸点高沸点）二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯二氯甲烷三氯甲烷乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇乙腈水吡啶乙酸。通常按极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，
20、同类分子或官能团相似的彼此互溶的一般规律来选择，溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。一般对溶剂的要求是：（1）溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。（2）溶剂不能与中药成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。（3）溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。（4）沸点宜适中，便于回收反复使用。（二）提取方法用溶剂提取中药成分时，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法（见图1-1,1-2）及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎程度、提取时间、提取温度以及设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以综合考虑，所用容器一般为玻璃或搪瓷器皿。- 6 -图11 索式提取器 (a)
21、(b) (c)图1-2 回流提取装置(a) 是可以隔绝潮气的回流装置 (b) 是带有吸收反应中生成气体的回流装置(c) 为回流时，可以同时滴加液体的装置注：在上述各类回流冷凝装置中，球形冷凝管夹套中的冷却水自下而上流动。可根据烧瓶内液体的特性和沸点的高低选用水浴、油浴、石棉网直接加热等方式。在回流加热前，不要忘记在烧瓶内加入几粒沸石，以免暴沸。回流时应控制液体蒸气上升不超过两个球为宜。二、水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，且难溶或不溶于水的成分的提取，此类成分的沸点多在100以上，并在100左右有一定的蒸气压（装置见图1-3） 。水蒸气蒸馏原理，简言之，就是
22、当水和不（或难）溶于水的化合物一起存在时，整个体系的蒸气压力根据道尔顿分压定律，应为各组分蒸气压力之和。即：P= P 水 + PA （P A为与不（或难）溶化合物的蒸气压） ，当P与外界大气压相等时，混合物就沸腾，这时的温度即为它们的沸点，所以混合物的沸点将比任何一组分的沸点都要低一些。而且在低于100的温度下随水蒸气一起蒸馏出来。如中药中的挥发油（装置见图1-4），某些小分子生物碱，如麻黄碱、槟榔碱等，以及某些小分子的酸性物质，如丹皮酚等均可应用本法提取。对一些在水中溶解度较大的挥发性成分可采用蒸馏液重新蒸馏的办法，收集最先馏出部分，使挥发油分层，或用盐析法将蒸馏液中挥发性成分分离出来或用低
23、沸点非极性溶剂如石油醚、乙醚将蒸馏液中挥发性成分提取出来。- 7 -图 1-3 水蒸气蒸馏装置水蒸气蒸馏装置的安装:（1）固定热源酒精灯（可调电炉）。（2）固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如上图所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。（3）安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。（4）连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。（5）连接接液管（或称尾接管）。（6）将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接受器，接收瓶应在实验前称重，并做好记录。（7）将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。挥发油测定器(用于比重小于 1.0) 挥发油测定器(用于比重大于 1.0) 图1-4 挥发油提取装置三、分馏法分馏法是利用混合物中各组分沸点不同进行分馏，然后精制纯化，对于完全能够互溶的液体冷凝管接收器烧瓶
