1、医学遗传学实验讲义浙江大学医学院医学遗传学课程组2012 年 9 月 3 日2实验一 人类外周血染色体标本制备一、实验目的通过实验了解和掌握人类外周血染色体标本培养和制备的基本方法。 二、实验原理正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在 G1 期或 G0 期，外周血细胞中是没有分裂相的。1960 年，Nowell 和 Morhead 证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）或其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。这样经过短期培养（colchicine） ，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便
2、地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 三、实验准备 实验材料人外周血 （淋巴细胞） 实验器具离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、刻度离心管、注射器和针头（6 1/2 号） 、吸管、量筒、火柴、酒精灯、pH 计、研钵、饭盒、超净工作台、镊子、载玻片、玻片盒、烧杯、染缸、试管架、玻璃铅笔或记号笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。 药品和试剂 1培养液的配制 RPMI1640 培养基 (含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠 ) 80% 小牛血清(56水浴灭活 30 分钟，灭活可破坏补体及一些污染的病毒) 20% 植物血凝素 PHA (主要成分是粘多
3、糖和蛋白质,可用培养基溶解) 4% 青霉素终浓度 100U/ml 链霉素终浓度 100U/ml用 3.5%NaHCO3 调 pH7.07.2，用玻璃滤器，抽滤灭菌。在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基 5 ml） 。培养液置于-20 冰箱保存。使用前从冰箱中取出，温育至37。2肝素浓度为 0.2%，作为抗凝剂使用。 200 mg 肝素粉末溶于 100 ml 生理盐水中。高压灭菌，-4冰箱保存备用。 3KCl浓度为 0.075 M，0.559 g 氯化钾溶于 100 ml 双蒸水中。氯化钾作为低渗液的优点是染色体轮廓清楚，可染性增强，时间缩短。4秋水仙素10 g/ml，作为有丝分裂的阻止剂
4、，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称取 10 mg 秋水仙素溶于 100 ml 生理盐水中，配成 100 g/ml 的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20 冰箱保存备用。临用时取上述原液用生理盐水稀释成 10 g/ml。5甲醇 6冰醋酸 7吉姆沙(Giemsa)染液 吉姆沙原液：先将 0.5g 吉姆沙粉末干研磨，时间越长越好；加 33 ml 60预热的纯甘油，在研钵中研磨，放在 60恒温水浴中保温 90 分钟。冷却后，再加入 33 ml 甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存，作为原液。原液要提前半年配制。原液中按比3例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。 1 份 Giemsa
5、 原液 9 份磷酸缓冲液 8磷酸缓冲液(pH 6.8) 溶液 A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078 g 溶于 1000ml 蒸馏水中。溶液 B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876 g 溶于 1000ml 蒸馏水中。100ml 缓冲液：需溶液 A50.8 ml，溶液 B 49.2 ml。 四、实验步骤1采血 先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取 2 ml 干燥灭菌注射器，配上针头（ 6 1/2 号）并吸取肝素液 0.2 ml 湿润针筒，采静脉血 2 ml，转动针筒使血与肝素混匀。2培养采血完毕立即将针头插入含 RPMI 1640 培养瓶内（瓶盖预先用酒精棉球消毒
6、） ，每瓶滴入 30 滴血，摇匀。2 ml 血可分装三至四瓶。置 37 0.5恒温中培养 72 小时，其间可摇动 23 次。3秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前 23 小时，加入秋水仙素，6 1/2 号针头 3 滴（每 ml 约 60 滴） ，使细胞分裂终止在中期。秋水仙素的浓度不宜过高和作用时间过长，虽然这样做可以得到较多的分裂相，但导致染色体过分缩短，不宜用于显带分析。4离心 将培养物倒入刻度离心管内，以 1000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，留底层沉淀物并用吸管打匀。 5低渗处理 加 8 ml 预温(37)的 0.075 M KCl 低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低
7、渗液中，37水浴箱静止 2530 分钟，使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。低渗处理的效果与低渗的成分、处理的时间和温度有关。这是比较关键的一步，对任一组织和低渗液都要事先进行预实验，以确定最合适的处理时间。6预固定 在低渗 2530 分钟后，加新配置的固定剂（甲醇:冰醋酸， 3:1 ）1ml，打匀。这样有助于细胞的均匀悬浮而不团聚凝块和防止细胞丢失。甲醇和冰醋酸要现配现用，如放置时间较长，即不宜再用，以免影响固定效果。 7再离心 1000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，留沉淀物。 8固定 沿离心管壁加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，3:1 ）至 5ml，将沉淀物打匀，固定1525分
8、钟。 9再离心 1000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液。 10再固定： 加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，1:3 ）至 5 ml 打匀，固定 1525 分钟。 11再离心 1000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液。 412再固定 加入新配制的固定液（甲醇:冰醋酸，1:1 ）至 5 ml 打匀，固定 1525 分钟，或冰箱中放置数小时，也可以过夜。13制片经上述固定后，1000 rpm 离心留下约 0.3 ml 沉淀物，打匀。用吸管吸取细胞悬液，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在酒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（或用电吹风吹干） 。14染色用 Gie
9、msa 染液染色 8 分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15镜检 将染色后的玻片先用低倍镜全面检查，找到良好的分裂相，换用高倍镜、油镜观察分析。五、注意事项1在采血接种培养时，注意不要加入太多的肝素。肝素过多时可能引起溶血和抑制淋巴细胞的转化和分裂；但肝素也不能过少，以免发生凝血现象。2培养基中不含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，则溶解有 RPMI 1640 培养基的液体可先用浓盐酸调 pH4.0，然后高压灭菌（注意 121，0.15 MPa，灭菌 15 分钟） 。冷却后，再加入 L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、PHA 、灭活小牛血清和双抗，再调 pH7.0，分装备用。L-谷氨酰胺和碳酸氢钠用微孔滤膜过滤灭菌
10、，不能高压灭菌。3接种的血样愈新鲜愈好，最好在 24 小时内培养。如果不能立刻培养，应置于 4冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。4温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为 370.5，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培养时间。培养液的最适 pH7.27.4，偏酸，细胞发育不良；偏碱，细胞会出现轻度固缩。5PHA 的质量和浓度是培养成败的关键问题。PHA 如果保存时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。6培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，继续培养。7最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降
11、在管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。8培养失败的可能原因（1） 培养瓶等器材洗涤不合要求。（2） 配制培养液使用的二或三蒸水不合要求。（3） PHA 和培养基存放时间过长。（4） 无菌操作不符合要求，发生细菌污染。9标本质量不佳的原因（1） 秋水仙素处理不当。 秋水仙素的浓度、处理时间不够，结果分裂相少；如果秋水仙素的浓度过高、处理时间过长，则使染色体过于缩短，难以进行分析。工作时，需要摸索处理时间和浓度。（2） 低渗处理不当。低渗时间过长时，细胞膜往往过早破裂，导致分裂细胞丢失或染色体丢失；低渗处理时间不足时，细胞膨胀不够，染色体分散不佳，难以进行染色体计数和分析。低渗时
12、间的掌握与气温有关。（3） 离心速度不合适。如果从培养瓶收集细胞进行离心时的速度太低，细胞丢失；5如低渗后离心速度过高，则往往分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相多被丢失。（4） 固定不充分。如固定液不新鲜，染色体形象模糊，呈毛刷状，染色体周围有胞浆背景。因此，固定液纯度要高，临用时新鲜配制。六、作业选择观察 10 个较好的细胞分裂相，计数染色体数目。 附 染色体培养实验器材的准备细胞培养和染色体制片过程中所用的培养瓶等玻璃器材和橡皮塞等在使用前，都要经过严格的洗刷、浸泡、蒸馏水洗和灭菌等过程，以保证清洁无菌。一、器材的清洗 1清洗液的配制重铬酸钾 120g浓硫酸 160ml蒸馏水 1000ml
13、先将重铬酸钾倒入蒸馏水中，然后慢慢加入浓硫酸，边加入边用玻璃棒搅拌。由于加入浓硫酸时会产生高温，所以不能用玻璃容器，而可用塑料桶或陶瓷缸。配制好的清洁液，应储存在有盖的容器内。如清洁液已呈绿黑色时，表明已经失效，不能再用。硫酸的腐蚀性强，操作时要戴防护手套，不能用金属镊子去夹玻璃瓶等。2一般玻璃器皿的处理玻璃器皿先用自来水洗去赃物，用肥皂液煮沸 30 分钟后，趁热刷洗干净，用自来水冲洗去掉肥皂残迹，空气干燥。放入清洁液中浸泡 1 天，然后取出，自来水充分冲洗，在蒸馏水中浸泡一天，再换一次蒸馏水，浸泡一天。置 80 烤箱中烘干。用牛皮纸包扎瓶口，干热灭菌 150 2 小时。3玻璃细菌滤器的处理新
14、购滤器用自来水刷洗后，装上新配洗涤液（化学纯浓硫酸 6ml，化学纯硝酸钠 2g，蒸馏水 100 ml） ，让其自然滤过，然后用自来水、蒸馏水反复滤过，接着用 1M 的 NaOH溶液过滤至液体呈中性。空气干燥，用牛皮纸或玻璃纸包好，高压灭菌。用过的滤器必须立即进行清洗，先在清洁液中浸泡一天，然后自来水冲洗，蒸馏水浸泡一天，蒸馏水抽滤多次，使堵塞滤孔的物质完全除去。4橡胶类制品的处理新橡胶类制品用水刷洗后，用 2%的 NaOH 溶液煮沸 20 分钟，然后用自来水冲洗，用2%的 HCl 溶液煮沸 20 分钟，自来水洗，蒸馏水中浸泡 24 小时，晾干，牛皮纸包扎，高压灭菌。用过的橡胶类制品立即泡于清水
15、中，用肥皂液刷洗后，用自来水冲洗，蒸馏水中浸泡24 小时，晾干，牛皮纸或玻璃纸包扎，高压灭菌。5载玻片的处理将载玻片一片一片放入肥皂溶液煮沸 20 分钟，刷洗干净后，用自来水冲洗，蒸馏水中浸泡 24 小时，放入装有蒸馏水的饭盒中，置冰箱中冷冻待用。二、灭菌1干热灭菌 （dry heat sterilization）一般采用电热鼓风干燥箱进行干热灭菌。一般玻璃和金属器材都可使用干热灭菌，较为方便。布类、橡皮类、液体不能用干热灭菌。灭菌时的温度和时间是：150干烤 2 小时。必须注意以下事项：（1） 放置入烤箱的物品，要间隔一定距离，以免影响灭菌效果。特别不要将包扎6纸直接与烤箱箱壁或箱底接触，以
16、免在高温下烤焦、起火。（2） 烤箱电源打开后，门上应挂一个标示牌，以免他人误开箱门，使冷空气突然进入烤箱，造成玻璃器皿破裂。（3） 先加热至 80左右，使箱内空气完全排空后，再关闭气门，150烤 2 小时后自然冷却。（4） 干热灭菌过程中，应有专人负责照看。2高压灭菌 (autoclaving sterilization)一般用手提式电热高压蒸汽灭菌锅，既经济又省时，效果也好，是实验室经常采用的方法。一般玻璃器材、玻璃滤器、橡胶类制品、布类和一些溶液都可用高压灭菌。灭菌时不要装的太满，液体不要装瓶过满，瓶塞上插上一个注射针头，以免高压过程中容器炸裂或瓶塞掉出。拧紧锅盖后，打开电源，打开排气孔，
17、待升温至排气孔排出气流呈直线，冷空气已基本排出时，关上排气孔。直至气压达 0.15 MPa 后，继续灭菌 20 分钟。灭菌完毕后，关上电源，待压力自然下降，温度降低后再打开锅盖，取出物品。趁热放入 80烘箱内烘干待用。3过滤除菌 ( filter sterilization )细胞培养中的常用的生物性物质，如培养液、血清、酶溶液等不能用高热或高压灭菌，只能用过滤法除菌。此外，NaHCO3 等类物质遇高热时会发生分解，故需要用过滤法除菌。（1） 玻璃滤器有六个型号，其中 G6 型滤器可以有效的除菌。玻璃滤器在高压灭菌之后，板上将析出少量碱性物质，所以，用它过滤后，液体的 pH 值将会有所增高，因
18、此，在调配液体时应考虑这一情况。用玻璃滤器抽滤时，抽滤不要过快，以滤液分滴滤下较为合适。注意避免液体抽干后仍在继续抽滤。（2） 微孔滤器滤膜常用醋酸纤维薄膜，具有灵敏度高、方便、经济省时的优点。滤器的后方接一个5ml 的注射器。滤膜可以耐高压灭菌，0.2 m 孔径的内膜的除菌效果即与 G6 型玻璃滤器相当。7实验二 人类染色体核型分析一、实验目的通过实验掌握染色体核型分析的常用方法以及 G 带的带型特征和识别技巧，初步学会识别 G 带染色体。二、实验原理 将一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像就称之为该细胞的核型(karyotype)，这通常是用显微摄影得到的染色体相片剪贴而成（
19、目前可通过相关软件在电脑中自动排列） 。在显带技术问世以前，人们主要根据染色体的大小、着丝粒的位置，将人类染色体顺次由 1 编到 22 号，并分为七组。但要想精确、有把握地鉴别每条染色体是比较困难的。70 年代初出现了染色体显带技术，不仅解决了染色体识别困难的问题，而且为深入研究染色体异常及基因定位创造了条件。将染色体标本用显带方法处理后，再用 Giemsa染色，这类技术就称为 G 分带，通过显微摄影，就可得到 G 带染色体的显微相片。 三、实验准备实验材料：显微相片 1 份 2 张。 实验器材：镊子、剪刀、胶水、实验报告纸。 四、实验步骤 1先贴一张相片于报告纸上方。 2将另一相片上的染色体
20、逐个剪下，按丹佛和人类染色体遗传学命名的国际体制（ISCN）排列编号。粘贴时短臂向上，长臂向下。 3在分析结果中，写出该细胞的核型式，注明性染色体。 五、作业 剪贴正常男性或女性染色体显微相片一张。 附 人类染色体 G 分带特征描述 1 号染色体最突出的特征是在长臂近着丝粒处有一块浓染的块状物质。长臂有 5 条深带，中央一条最宽最深。短臂近着丝粒端 1/2 处有 2 条宽阔的深带，远端有 34 条较窄的淡带。2 号染色体与 1 号染色体相比为亚中着丝粒并缺乏明显的界标。长臂有 45 条分布均匀的深带，中央 2 个常融合为 1 个带。3 号染色体中央着丝粒染色体，带型近乎对称。两臂的近端和远端染
21、色甚深，而中心部位染色较浅。84 号染色体与 5 染色体相比着色均匀。长臂上有 45 条很均匀的深带，短臂中央有 12 条深带。5 号染色体长臂中部有一宽的中央带，远端有 2 个深带。短臂可见 12 条深带，远端的深带宽且色浓。6 号染色体 长臂有 4 条均匀的带，短臂中部有一明显而宽阔的浅带，其近、远端各有一深带，近端深带紧贴着丝粒。7 号染色体 长臂有 3 条带，远端一条较浅。短臂上有 3 条深带，远端一条较宽且色深，有如“瓶盖” 。8 号染色体长臂中部有一宽带，短臂有 2 条分布均匀的深带，中部有一较明显的浅带。9 号染色体长臂有 2 条均匀隔开的明显深带，短臂有特别的心形外貌，近端和中
22、部各有一深带。 10 号染色体长臂有 3 条明显的深带，其中近端一条带最深，短臂近端和近中部有一宽带。 11 号染色体 长臂紧贴着丝粒有一深带，远端可见一明显的较宽的深带，这条深带与近端的深带之间的 1 条宽阔的浅带。短臂近中部有一深带。12 号染色体 长臂紧贴着丝粒有一深带，中部有一宽的深带，这条深带与近端深带之间有一明显浅带。但与 11 号染色体比较，这条浅带较窄，是区别 11、12 号染色体的主要特征。 13 号染色体 长臂可见 4 条深带。 14 号染色体 长臂近端有一深带，其远端也有一明显的深带。 15 号染色体 长臂近中部有一明显的深带，远端着色浅，有时可见 2 条浅带。16 号染
23、色体 长臂中和远端各有一深带，有时远端不明显。短臂染色浅，可有 12 条带。 17 号染色体长臂远端有一深带，这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。短臂上的一条窄带紧贴着丝粒。 18 号染色体 长臂有 2 条宽带，近端一条较远端的宽些，短臂上有一窄带。19 号染色体着丝粒及周围为深带，其余均为浅带。 20 号染色体两臂的远端着色，短臂着色较长臂深些。 921 号染色体长臂近端有一宽阔深带，远端浅染。 22 号染色体长臂上有 2 条深带，近端的一条着色深，紧贴着丝粒。近中部的一条着色浅，有时不显现。X 染色体 长臂可见 45 条深带，近中央有一与短臂相似的深带，似“竹节”状。短臂中部有明显中央深
24、带。Y 染色体长臂有 2 条远端带，有时整个长臂被染成深带。带 型 识 别 口 诀一秃二蛇三蝶飘 四象鞭炮五黑腰 六号 1、4 小白脸七上八下九苗条 十号 q 肩带好 十一低来十二高十三、十四、十五号（3.2.1） 十六 q 缢痕大 十七 q 带脚镣十八人小大肚泡 十九是黑腰 二十头重脚底浅二十一象个葫芦瓢 二十二头小，身子大 X 扁担，两头挑人类染色体核型分析实验报告 班级 -姓名 - 标本编号： 分析结果： 1 2 3 4 5 A B 6 7 8 9 10 11 1210 C 13 14 15 16 17 18 19 20 D E F 21 22 G 性染色体实验三 人类染色体 G 带标本
25、制备及观察一、实验目的通过实验掌握 G 带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察 G 带分裂相。 二、实验原理有许多显示 G 带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到 37胰酶中进行处理，然后用 Giemsa 染色。通过胰酶处理使 G 带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态，由此可见在 G 带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。Giemsa 染料是由天青和伊红组成的，染色首先取决于二个天青分子同 DNA 结合，在此基础上结合一个伊红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。 三、实验准备 实验材料 常规的人类体外周血染色体制片。 实验器材恒温水浴箱、烧杯、染缸、显微镜附油镜头、香柏油、擦镜纸、恒温培养箱、镊子、记号笔或铅笔等。药品和试剂 1Hanks 液NaCI 2.0 gKCI 0.1 g Na2HPO4.12H2O 0.0375 gK2HPO4 0.015 g葡萄糖 0.25 g
