蛋白提取方法.ppt

蛋白提取浅谈,合伙人：李富生、袁倩、贺位皇 2015-1-19,5,第一谈：蛋白的个性 第二谈：捕获蛋白的网 第三谈： 冷丙酮和苯酚提取的命脉 第四谈：蛋白提取哪加强,蛋白提取,第一谈：蛋白的个性,按蛋白物种类别，蛋白可分为： 1.植物蛋白（色素） 2.动物蛋白 3.微生物蛋白（培养基洗脱）,4,根据蛋白的溶解性，蛋白可分为： 1.可溶性蛋白质 ：可溶性蛋白质是指可溶于水、稀中性盐和稀酸溶液。 可溶性蛋白约占总蛋白含量的80% 2.醇溶性蛋白质： 一类不溶于水而溶于70％～80%乙醇的蛋白质。 3.不溶性蛋白质 ：此类蛋白质既不溶于水、稀盐溶液，也不溶于一般有机溶剂,——针对溶解性如此调皮的蛋白，我们该用什么溶剂感化它呢？ ——L3裂解液（尿素、SDS、Tris）,第二谈：捕获蛋白的网 1 . 高浓度中性盐沉淀法（盐析）（不变性）,2. 有机溶剂沉淀法,,原理：脱水作用和降低介电常数 破坏了水化层 破坏了双电层，增加带电 质点间的相互作用,,,,,,,,3. 等电点沉淀法 原理： 净电荷为0，彼此失去了电荷排斥作用而趋于凝聚。 4. 重金属盐沉淀法 原理：当溶液的PH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电，这样它就容易与重金属离子结成不溶性盐而沉淀。 5. 有机酸沉淀法 原理：当溶液的PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电，它就与生物碱试剂或酸类发生反应生成不溶性盐而沉淀。,有机溶剂沉淀法相比其他沉淀法的优缺点： 优点 1.分辨能力高，即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 2.根据实验要求选择最合适的溶剂可以使实验尽可能准确。 3.成本较低。 缺点 容易引起蛋白质变性失活，操作常需在低温下进行。且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。,第三谈：冷丙酮和苯酚提取的命脉,,丙酮沉淀蛋白的机理是： 根据库伦定律，溶液介电常数的下降（丙酮25摄氏度时介电常数为21，水为81），造成静电作用力的增强，同时，丙酮与蛋白对水的争夺直接导致水化层的破坏，从而造成蛋白沉降。 丙酮造成蛋白变性的原因： 常温或升温时，蛋白立体结构展开，丙酮极容易与其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸进行疏水结合导致蛋白变性，所以我们通常预冷丙酮并且低温操作。低浓度的盐不会沉淀，但是通常盐浓度高于0.1molL时，因为介电常数的降低导致盐的溶解度也下降而析出。初始蛋白浓度不易过高，很容易造成共沉淀。,冷丙酮沉淀 1.冷丙酮沉淀的时间与温度。 2.超声功率和时间，重在观察超声后样品溶性的均匀度。 3.还原烷基化。 苯酚提取 1.各种试剂的正确及精确配置。（如：蔗糖提取液） 2.加入饱和酚后的充分震荡和离心。（使蛋白充分与酚、色素H键结合，让其分三层） 3.纯化蛋白。（甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯酚等杂质）,实例：P140678野生番木瓜蛋白提取,,第四谈：蛋白提取哪加强,1.冷丙酮沉淀时间。 在蛋白提取操作流程中，最为耗时的属于冷丙酮沉淀这一步，一般沉淀2h甚至过夜。 在提取质量保证的前提下，如何压缩冷丙酮沉淀的时间，或者找到一个最适宜的时间，这是一个值得探讨的问题。因为时间的大大缩短，不仅可以提高效率，而且可以提高产率。,以大麦麦粒为研究对象（植物杂质多，蛋白提取率 低） 采用单一变量原则，只控制冷丙酮沉淀时间的不同，设时间为t，取四个有代表性的时间点：10、30、60、120（单位：min） 使用TCA/冷丙酮沉淀蛋白流程， 最后得胶图：,由胶图可以看出，各时间段胶图条带相似，无明显差别，可见，沉淀蛋白时间的长短，对蛋白含量分布，没有什么重大影响。 由定量数据可知，冷丙酮沉淀大麦的时间为10min时，蛋白浓度最高，且可以推出随着沉淀时间的增长，蛋白的终浓度有所下降。 许多研究表明，冷丙酮沉淀蛋白时间过长会导致蛋白质降解，时间过短会使蛋白质沉淀不完全。,,2.还有呢？ 。。。。。。。。。。。。。。。。。。,,