免疫药实验方法-药理实验方法学-研究生.ppt

1,影响免疫功能药物药理研究方法 中药药理教研室 洪敏 唐仲英科技楼406 Tel：15805191595 Email:hongmin72@126.com,2,第一节 概述 一、免疫学研究概况 免疫学的3个时期： 经验免疫期 科学免疫期 现代免疫期,3,●经验免疫学时期 中国明代，正式记载接种“人痘”，预防天花 18世纪中叶，英国医生Edward Jenner 种牛痘预防天花 目前，通过全球性大面积疫苗接种我们已经消灭了天花病毒,4,5,● 科学免疫学时期,病原菌的发现与疫苗使用的推广 19世纪中叶，显微镜的改进使人们可在镜下直接观察到细菌，导致病原菌的发现。 1850年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽杆菌。 Pasteur证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物感染致病，并且发明了液体培养基，以培养细菌。 Koch发明固体培养基，分离培养结核杆菌成功，提出病原菌致病的概念。,Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel Prize in 1901 for demonstrating that circulating antitoxins against diphtheria（白喉）and tetanus（破伤风）toxins conferred immunity.,Louis Pasteur 1822-1895, Father of immunology, attenuated bacteria and viruses as vaccine against anthrax（炭疽）…..,Edward Jenner 1749-1822 Successful vaccination against smallpox（天花）,Robert Koch 1843-1910, Nobel Prize in 1905 for his work on tuberculosis（肺结核）, Anthrax（炭疽）, Cholera（霍乱）, Tubercule bacillus（结核杆菌）,8,科学免疫学时期的重要成就,减毒疫苗的发明 抗毒素的发现 补体的发现 血清学方法的建立 免疫化学的研究,●现代免疫学时期,免疫应答细胞和T细胞亚类的发现 免疫网络学说的提出 抗体生成克隆选择学说的提出 细胞因子研究进展 免疫学技术的发展（免疫标记技术） 免疫耐受现象的发现,,Clonal Selection Theory （ Burnet学说, 1960年诺贝尔奖） 体内存有能识别各种抗原的细胞克隆(clone)，每一细胞表面均有对特定抗原的受体，能与相应抗原结合而识别它们。 抗原的作用在于选择与其相应的细胞克隆与其受体结合后，引起细胞的增殖分化，产生免疫应答。 胎生期免疫细胞与自己抗原相接触形成天然自身耐受状态（禁忌细胞系） 免疫细胞系可突变产生与自己抗原发生反应的细胞系可形成自身免疫反应 此学说对免疫学中的根本问题——自我识别有了比较满意的解释，对免疫学中的其他重要问题，诸如免疫记忆、免疫耐受性、自身免疫性等现象也能作出恰当的说明，因此被人们广为接受，成为现代免疫学的理论基础。,11,,12,● 研究进展,1.抗原识别受体多样性的产生 2.信号转导途径的发现 3.细胞程序性死亡途径的发现 4.造血与免疫细胞的发育 5.应用免疫学的发展 (1)DNA疫苗 (2)基因工程制备重组细胞因子 (3)免疫细胞治疗 (4)完全人源抗体 (5)口服自身抗原,预防自身免疫病,13,二、免疫功能的病理生理及免疫功能的调节 ● 免疫应答：是机体借助理化屏障及神经体液调节控制，通过免疫细胞及有关的体液因子（抗体or淋巴因子等）发挥识别自己、排除异己，以维持机体内外环境统一的一种功能。 ● 非特异性免疫应答：是机体防御异物进入机体以及对进入体内异物的清除作用，是机体与生俱来的免疫功能。 ● 特异性免疫应答：是机体发育过程中接触抗原后发展而成的免疫力，包括体液免疫和细胞免疫。,14,免疫应答的3个阶段： （1）感应期 抗原进入机体后，多数由单核－巨噬细胞摄取与加工，再将抗原信息传递给T、B淋巴细胞，使之能特异性地识别抗原。 （2）增殖分化期 抗原激活――淋巴细胞――T、B淋巴细胞――致敏淋巴细胞、浆细胞。 （3）效应期 再次遇到抗原――致敏淋巴细胞、抗体――细胞免疫、体液免疫。,15,16,18,19,免疫病理与免疫性疾病,按发病机制不同,免疫性疾病分为： 超敏反应性疾病 免疫缺陷病：先天性及继发型免疫缺陷病 自身免疫病：类风湿性关节，系统性红斑狼疮,干燥 综合征,多发性硬化 移植排斥和移植物抗宿主反应,,,速发型：由抗体介导， 发作快 如：哮喘、荨麻疹等 迟发型：由细胞免疫介导，发作慢 见于结核病、接触性皮炎,,20,目前临床所用的影响免疫功能的药物有： ● 免疫增强药：胸腺素、卡介苗、干扰素（免疫调节）、左旋咪唑等。 ● 免疫抑制药：环孢素A、他克莫司、糖皮质激素、环磷酰胺、抗淋巴细胞球蛋白。 ● 中药类： 双向免疫调节，如：人参、黄芪、灵芝、猪苓、枸杞、银耳、鹿茸、云芝等植物多糖。 免疫抑制，如：川乌总碱、氧化苦参碱、雷公藤多苷、生物碱等。,21,中国医院用药评价与分析,2009;9(10):726-729,22,三、研究的基本要求 （一）动物的选择 由于免疫反应和基因类型有关，尽可能用纯系动物。如纯系小鼠和大鼠，并控制鼠龄、性别和体重，以减少个体差异。若用杂种动物，最好用同窝动物。,23,（二） 动物模型 1、模型特点和要求 （1）正常实验动物 （2）免疫功能低下的动物模型（肿瘤、衰老、慢性病均可造成免疫功能低下） ① 免疫抑制剂造模（如环磷酰胺、氢化可的松、环孢霉素A） ② 辐射引起免疫功能低下动物模型,24,常用的免疫抑制剂 1. 环磷酰胺：80～100mg/kg，Sc，5天后免疫功能显著降低。 2. 氢化可的松：50～100mg/kg，Sc，6～8天后免疫功能显著降低。 3. 抗淋巴细胞血清（ALS）:ip 0.2ml，5～6天后免疫功能显著降低。 4. 60Co或X射线600～800拉德照射1次，4日后免疫功能显著降低，动物存活时间显著缩短。,25,（3）免疫缺陷动物 Nude小鼠：该小鼠先天性无胸腺，细胞免疫力低下，失去正常T细胞功能。但其B淋巴细胞功能基本正常。BALB/c–nu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu   Scid小鼠：即重度联合免疫缺陷小鼠。Scid 小鼠外观与普通小鼠差别不大，有毛，被毛白色，体重发育正常。但胸腺、脾、淋巴结的重量不及正常的30%，组织学上表现为淋巴细胞显著缺陷。 BALB/c-Scid,26,（4）自身免疫性疾病模型： 类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、多发性硬化症 （5）过敏性疾病模型： 哮喘，过敏性鼻炎，接触性皮炎等,,27,佐剂性关节炎模型 是免疫性关节炎动物模型的基本方法。 造模多采用大鼠, 足跖部皮下注射法, 原发病变主要表现为致炎局部的炎症反应, 续发病变一般于致炎后10-20天左右出现, 20天左右达到高峰, 病理改变为滑膜下组织炎症, 滑膜增生, 血管翳形成, 软骨破坏, 4周后, 关节红肿减退, 骨质减少, 新骨形成, 关节间隙变窄, 形成不可逆的关节改变。 AA大鼠的关节组织病理学及血中变化与人相似, 同时, 对其免疫学机制研究发现, 此模型存在明显的细胞免疫异常。,28,II 型胶原诱导的关节炎模型 II 型胶原+完全弗氏佐剂, 乳化制成乳剂, 将该乳剂于小鼠的尾根部皮内注射致炎, 腹腔注射乳剂作为激发注射。 表现为多发性外周关节炎, 关节局部红肿, 严重致关节畸形, 病理变化为增生性滑膜炎, 关节软骨破坏, 骨侵蚀, 关节腔内有炎性细胞浸润, 体内可检出针对自身型胶原的高滴度的IgG抗体, 这些临床表现及实验室指标与人密切相关。 不出现病情的波动和复发情况, 也没有的皮下结节, 浆膜炎, 血管炎等表现,不出现类风湿因子及抗核抗体,29,卵蛋白诱导的关节炎模型 卵蛋白+福氏佐剂混匀, 注入动物背部皮下, 致敏, 末次注射后一周于关节内注入溶解的卵蛋白, 24小时内此关节出现红肿热痛等急性炎症的表现, 发病率达100%。 卵蛋白诱导的关节炎模型的病理改变有滑膜增生、血管翳形成和软骨及骨破坏。 第一阶段为关节内注入抗原后, 24小时出现关节肿胀, 关节直径增加, 病理表现为急性滑膜炎。 第二阶段为1-4周, 关节滑膜明显增生, 血管翳形成。滑膜细胞以单核细胞、巨噬细胞为主,其次为淋巴细胞, 以CD4+淋巴细胞多见, 这一阶段部分动物可出现早期软骨破坏。 第三阶段在4周后, 不可逆的关节软骨及骨破坏出现,最后可出现骨变形。最长的观察到6个月, 慢性炎症仍存在, 证明卵蛋白诱导的关节炎模型与在发病机理上的某些类似。,,30,2、观察指标 （1）非特异性免疫功能的测定指标 （2）体液免疫功能的测定指标 （3）细胞免疫功能的测定指标 3、给药途径和剂量 4、对照实验,31,,（1）组间对照,标准品对照组 弱阳性对照组,（2）自身对照 （3）配对对照,对照组,阴性对照组,空白对照组,假处理对照组,阳性对照组,,,,,32,第二节 实验方法 一、影响非特异性免疫功能实验 （一）碳粒廓清法 【基本原理】 网状内皮系统（RES）是机体最主要的防御系统，具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异物的能力，并能迅速清除体内自身产生的某些有害物质。 当静脉注入特定大小的惰性颗粒后，它即可被RES细胞迅速吞噬而从血流中廓清，因此，可借助测定血流中炭粒的消失速度来反映RES吞噬异物的能力。,33,【实验步骤】 （1）取小鼠，随机分组，给药。 （2）末次给药后30min，每鼠iv印度墨汁0.05～0.1ml/10g体重。 （3）于1min（t1）和5min（t5）后，每鼠眼眶静脉取血20ml，加到2ml 0.1%NaCO3溶液中摇匀。 （4）测OD680nm，计算廓清指数（K）、吞噬指数。,34,廓清指数K＝ ＝ 吞噬指数α＝ × 即校正廓清指数,,,,,35,【注意事项】 （1）印度墨汁应用NS稀释1～5倍左右，最好经超声处理后离心，弃去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛细血管，引起动物猝死。 印度墨汁的质量可影响测定结果的准确性，墨汁颗粒大小有严格要求，过大则不被吞噬，过小则被其他吞噬细胞吞噬，如小吞噬细胞。印度墨汁因颗粒大小均匀，能特异性地被单核巨噬细胞所吞噬，因而适用于本实验。 （2）iv要熟练，印度墨汁的剂量、取血时间必须准确无误。另外，取血的时间间隔也可延长至10分钟。,36,【评价】 印度墨汁法测定RES吞噬活性是最经典的一种免疫学研究方法，实验条件要求不高，方法简便，结果可靠，重现性好。 若再配合小鼠腹腔巨噬细胞吞噬消化鸡红血球实验及白细胞游走实验，则可较全面地反映单核巨噬细胞系统清除异物功能状态。,37,（二）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞法 【基本原理】 Mφ具有强大的吞噬能力，鸡红细胞对鼠类是一种较强的抗原性异物，当其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔Mφ聚集并吞噬，注入定量鸡红细胞（CRBC），隔一定时间后，吸取腹腔Mφ，镜检其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指数的高低表示Mφ吞噬能力的大小。,38,【实验步骤】 （1）取18～22g小鼠，雌雄各半，随机分组。 （2）若筛选免疫抑制药，预先用Mφ诱导剂，可在实验前3～4天，ip0.5％淀粉生理盐水溶液，每鼠0.5ml。 （3）4天后，ip，5％ CRBC 0.5ml。8～12h后脱颈椎处死小鼠，ip2ml NS，轻揉腹部1min，然后吸出洗液1ml，分滴于两片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。 （4）用NS漂洗，除去未粘片的细胞。晾干，1∶1丙酮－甲醇溶液固定5min。4％（V/V）Giemsa－磷酸缓冲液染色3min，用流水冲洗、晾干，镜检。,39,【结果判定】 油镜下计每片200个Mφ，计算吞噬百分率、吞噬指数。 吞噬百分率＝ ×100％ 吞噬指数＝ ÷2,,40,CRBC被消化的程度，通常分4级： Ⅰ级：未消化。CRBC完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核呈浅紫红色。 Ⅱ级：轻度消化。胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。 Ⅲ级：重度消化。胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。 Ⅳ级：完全消化。Mφ内仅见形态类似CRBC大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。,41,【注意事项】 （1）实验各步骤均需保持无菌操作。Mφ诱导剂仅用于免疫抑制药研究。 （2）若滴片染色过深，可用1%HCl脱色，过浅则可复染。 （3）每鼠两片的计数应基本一致，若差距过大，应予淘汰。腹腔吸出的液体若有血性渗出时，则不宜使用。,42,（4）掌握好实验时间，时间太短，吞噬鸡红细胞较少，过长则鸡红细胞已被消化。 （5）避免腹腔注射受试药物，以免干扰实验结果。 【评价】 本法简便，但操作慢而欠精确，可配合其他方法进行综合分析。,43,（三）巨噬细胞吞噬作用的化学发光测定法 【基本原理】 化学反应中电子激发态产物，在其回到基态过程中，以光的形式释放能量or将能量转移到另一分子而发射光子，利用发光检测仪测定发射光的强度or速度，即可计算发光物质or发光物质标记的抗原or抗体的含量。测定发光强度的方法，即光子计数法，可用液体闪烁仪进行测定。,44,Mφ吞噬颗粒or受其他生物与化学因子刺激后，细胞代谢猛增，其特征是耗氧量增加，产生大量自由基（氧负离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧），同时，往往伴有化学发光现象，但十分微弱，难以检测。若在体系中加入鲁米诺等发光增强剂，就能增强发光强度，因为氧化剂激发鲁米诺，可发出425nm的光，易被检测到。,45,【操作步骤】 （1）用HBSS将Mφ调整至2×106个/ml的细胞悬液备用。 （2）取细胞悬液1ml，置聚乙烯小管中，加入10-4M鲁米诺200ml，将小管放入液闪测量瓶中，测定发光6秒钟，作为本底。 （3）加入调理的酵母多糖200ml，摇匀，即刻测发光6秒钟，以后每隔3～5min测一次发光，直至加酵母多糖1h。 （4）以发光强度（cpm）为纵坐标，加酵母多糖后的时间为横坐标，绘制Mφ吞噬发光的动力曲线。比较各组的峰高、峰时（峰高的时间）、发光积分值及早期曲线斜率的变化。,46,【注意事项】 （1）注意无菌操作。所用试管、滴管、缓冲液等均需高压灭菌，应在超净台内操作，避免污染。 （2）用台盼蓝染色，Mφ活力应在90％以上。 （3）所用药物应能完全溶解，悬浮的微粒将会影响Mφ的反应性。 （4）小试管与测量瓶先置暗室24h，整个操作系统均在暗室进行。,47,【方法评价】 （1）本法也可检测Mφ氧代谢功能与血清调理作用，故作为检测吞噬功能的指标的专一性不够。 （2）因液闪仪无温控装置，不能使反应系统达到37℃，只能通过恒定的室温（25±1℃）与水浴37℃进行间接控制。,48,（四）溶菌酶测定法 【基本原理】 溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、痰、鼻涕、WBC、血清等。测定它在体液or分泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防御功能的一个指标。 体液和分泌物中的溶菌酶活性，可通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定。,49,2种测定法： （1）光学测定法：将检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数。 （2）平板打孔测定法：在混有菌液的琼脂凝胶上打孔，检品放在孔内，一定时间后测定溶菌环直径。,50,二、影响特异性体液免疫功能的实验方法 （一）血清溶血素测定法 【基本原理】 经SRBC免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBC抗体（溶血素），并释放至外周血。这种抗体在试管内与SRBC温育，在补体（正常血清中的一组酶蛋白，具有溶解和杀伤细胞，增强吞噬等作用）参与下可产生溶血反应，通过测定血红蛋白的释放量多少来间接测出血清中溶血素的含量。 血红蛋白与都氏试剂反应形成氰化血红蛋白后比色测定。,51,【操作步骤】 （1）免疫：小鼠，ip 20％SRBC 0.2ml/天，第4天取血、分离血清，将血清稀释后供测定（一般500倍以上）。 （2）溶血反应：在试管内依次加入血清1ml、5％SRBC 0.5ml、10％补体1ml，置37℃水浴30min，然后移至冰浴中终止反应，1500rpm离心5min，取上清1ml，加都氏液3ml，摇匀放置10min，测OD540nm。,52,（3）SRBC半数溶血值：取5％SRBC 0.25ml加都氏液4ml，测OD540nm。 （4）计算：样品管半数溶血值HC50： 每只鼠的血清 HC50＝ ×稀释倍数,,53,【评价】 （1）简单易行，快速，重复性好。测定HC50较准确，客观，可克服溶血空斑法用肉眼计数的错误。 （2）本实验用615纯种小鼠测出的数据比较稳定，重现性好。,54,（二）抗体形成细胞测定法（PFC） 1 溶血空斑试验（haemolytic plaque assay，HPA） 【基本原理】 PFC是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。将SRBC免疫的小鼠脾细胞、SRBC、补体混合于琼脂内，抗体形成细胞分泌的抗体在补体的参与下，使其周围的SRBC的溶解形成肉眼可见的溶血空斑，这种溶血空斑大体上可以反映抗体形成细胞数。 方法：琼脂固相法（平皿法）：常用。 液相单层细胞法（玻片法）：很少使用。,56,直接溶血空斑试验:测定产生 IgM 型抗体的细胞。因为活化补体的能力强，只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。 间接溶血空斑试验: 产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，需要加靶细胞和抗各类 Ig 的抗血清,再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。,57,【操作步骤】 （1）琼脂固相法――直接法 1）免疫动物：选用纯系小鼠，随机分组，每鼠腹腔注射5％的SRBC 0.2ml致敏。 2）制备补体，同前。 3）制备底层琼脂：称取1.4g琼脂糖加入100mlGey’s液中，煮沸，溶化后分装若干只预温的试管，每管5ml，置45℃恒温水浴保温。然后倾入水平放置的平皿（直径9cm）中，凝固后打开平皿盖，将平皿反扣放入37℃温箱1h，备用。,58,4）制备脾细胞悬液：免疫后第4天，用冷Gey’s制备107/ml脾细胞悬液，置4℃冰箱备用。 5）上层琼脂的制备：称取0.7琼脂糖加入100mlGey’s液中煮沸，溶化后分装若干只预温的试管，每管1.5ml，置45℃恒温水浴保温。逐个取出，依次加入SRBC悬液（2×109/ml）0.1ml、107/ml脾细胞悬液0.1ml，充分混匀，立即倾入上述制备好的底层琼脂平皿中，均匀铺平，凝固后静止10min。,59,6）将平皿置37℃、5％CO2培养箱培养2h，每皿中加入1∶10稀释的豚鼠血清1.0ml，均匀覆盖于表面，继续温育40～50min，取出后置室温1h，4℃冰箱过夜，次日倾去补体，or加入0.25%的戊二醛（NS配置），使细胞固定后计数空斑。,60,7）空斑计数与评定：用放大镜or双目解剖镜可见每个空斑由抗体分泌细胞及其周围的透明区域组成。计数每个平皿（106个细胞）的空斑数。 （2）琼脂固相法――间接法：在上述5）中再加入适当浓度的抗-Ig血清0.1ml，其他步骤相同。,61,【注意事项】 （1）SRBC既是免疫细胞，又是靶细胞和指示细胞，故SRBC要新鲜，洗涤不得超过3次，每次离心5min。用Alsever’s液保存的SRBC可使用2周。 （2）为了消除非特异性溶血，豚鼠血清在使用前必须经SRBC吸收，补体的浓度以1∶10稀释为宜。,62,（3）制备脾细胞悬液：若将取出的脾立即放入0℃冰浴，可明显降低空斑计数；在20℃以下操作，不超过15min，对空斑计数并无影响。 （4）测定抗血清的显斑常数（KD）和抑斑常数（KI），作为空斑计数的校正。,63,（5）倾注底层琼脂糖时，一定要将平皿放置水平位置，以便使底层琼脂糖水平光滑。倾上层琼脂糖时，各种细胞成分要充分混匀。不能剧烈震荡，以免出现气泡。水浴温度应控制在47～49℃之间，温度过高使细胞变性；过低使琼脂糖凝固，影响细胞分散。,64,2 分光光度法 【基本原理】 又称SRBC的定量溶血测定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可定量测定抗体形成细胞所分泌的抗体，较溶血空斑法精确。同时操作比较简便。,65,【操作步骤】 （1）免疫动物：同前。 （2）制备脾细胞悬液：基本同前，制成5×106/ml脾细胞悬液，或按15mg脾重/ml制成脾细胞悬液。 （3）溶血反应：取试管若干只，每管依次加入脾细胞悬液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混匀，另设不加补体的空白组。置37℃水浴中温育1h，离心3000rpm，5min。 （4）测OD值：取上清测OD413nm。,66,【注意事项】 （1）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠的脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误差。 （2）反应系统中其他条件不变时，SRBC浓度可根据受试药的免疫增强or抑制作用作适当调整。,67,三、影响特异性细胞免疫功能的实验方法 （一）淋巴细胞转化试验（3H-TdR掺入法） 【基本原理】 淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下，转化为母细胞，并分化增殖，细胞内蛋白质和核酸合成增加，并释放多种淋巴因子。如在培养液中加入3H-TdR，使其掺入到新合成的DNA中，可以定量细胞内的DNA合成强度。,68,有丝分裂原： PHA（植物血凝素） ――刺激T细胞 Con-A（刀豆球蛋白） ――刺激T细胞 LPS（脂多糖） ――刺激B细胞,69,【操作步骤】 （1）纯系小鼠，2～3月龄，雌雄均可。处死小鼠，在无菌条件下迅速取出脾脏，放入盛有RPMI1640培养液的平皿中（冰浴），剪碎，用注射器针芯捣烂，过100目钢筛，制成脾细胞悬液。 （2）用培养液离心洗涤脾细胞3次，用台盼蓝检查活细胞数在95％以上。将细胞用培养液稀释成2×106个/ml。,70,（3）将脾细胞加入96孔培养板，每孔200μl，3～4复孔（也可更多）。加入有丝分裂原，培养72h。 （4）终止前6h，每孔加入3H-TdR 1ml，使其终浓度为1～5μci/ml。 （5）用微量多头细胞收集仪，将细胞抽吸在49型玻璃纤维滤纸上，置80℃烘箱内干燥30min。 （6）将烘干的滤纸片放入盛有闪烁液的小瓶中，用液闪仪测定样品中的放射强度（cpm）。,,72,【注意事项】 （1）无菌操作。 （2）脾细胞制备要放在冰浴中，避免细胞死亡带来误差。 （3）中药粗制剂中影响因素较多，注意假阳性。 【评价】 （1）3H-TdR掺入法客观准确。经典方法。 （2）可直接观察药物本身对淋巴细胞转化的影响，也可观察与有丝分裂原的协同or拮抗作用。,73,MTT法： 【基本原理】 Mosmann等根据细胞内能量代谢水平与DNA合成水平平行相关，首创了四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。MTT进入细胞后作为反应底物，被氧化成蓝色的甲臜（formazan），存积于细胞内及周围，加入DMSO，使细胞破裂，并使细胞内甲臜释放出来，测定OD490nm。,74,（二）二硝基氟苯诱导小鼠DTH反应 【基本原理】 DNFB是一种半抗原，将其溶液涂抹腹部皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4~7天后将其再次涂抹皮肤，可使局部产生DTH反应，一般在抗原攻击24~48h达高峰，故此时测定局部肿胀。,75,【操作步骤】 （1）致敏：小鼠，随机分组，腹部去毛，范围约3×3cm2，并将1％DNFB溶液均匀涂抹于腹部皮肤，必要时于次日再强化一次。 （2）DTH反应产生与测定：致敏后第5天，将1％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击，对照组同样涂耳但未致敏。,76,攻击24h后，脱颈处死小鼠，用直径8mm的打孔器打下圆形耳片，称重，以左右耳片总量之差为肿胀度；同时取小鼠胸腺及脾脏称重，计算脾指数和胸腺指数（以每10g体重计）。 【注意事项】 （1）DNFB溶液要临用前新鲜配制。 （2）在小鼠腹部应尽量去毛，且应避免剪破皮肤。 （3）操作者避免DNFB与皮肤接触。实验环境控制在20±2℃为宜。,小 结 一、影响非特异性免疫功能实验 （一）碳粒廓清法/吞噬鸡红细胞法/化学发光测定法(巨噬细胞) （二）溶菌酶测定法 （三）硝类兰四氮唑（NBT）还原试验(中性粒细胞) （四）NK细胞活性检测,LDH法 二、影响体液免疫功能的实验方法 （一）血清溶血素测定法 （二）抗体形成细胞测定法（PFC） （三）抗体水平的检测 三、影响细胞免疫功能的实验方法 （一）淋巴细胞转化试验 （二）DTH反应 （三）细胞因子测定 （四）细胞亚群检测,78,常用免疫学技术 免疫沉淀 利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗体－目的蛋白复合物，沉淀经洗涤后，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。,79,2.免疫转印技术 基本原理是将蛋白质先行电泳分带，然后将其转印到硝酸纤维素膜上，用标记信号分子（同位素、酶、荧光）的抗体进行结果判定。 Western blot,81,3.免疫组织化学技术,应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。,83,4.细胞因子的测定 1）mRNA的表达水平 RT-PCR，real-time PCR 2）生物活性测定法 IL-2，CTLL-2细胞株 3）酶联免疫测定法 ELISA 4）细胞内细胞因子测定 流式细胞术 5）蛋白质芯片技术,,84,ELISA （Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） 基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,ELISA的原理,85,ELISA的类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"immunosorbent； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。,Example TGF-1,,89,流式细胞术(flow cytometry，FCM)是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。该技术是一项集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学、免疫荧光细胞化学技术及单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。概括地说，流式细胞技术是通过流式细胞仪(flowcytometer)对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速和准确地定量分析和分选。 流式细胞术在生物医学领域中应用十分广泛。凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用于流式细胞仪检测。,90,CD3+CD8-IL-17+ Th17 anti-CD3-FITC，anti-CD8-PE，anti-IL-17-APC,Control,Depression,0.3,0.5,,91,CD3+CD4+ cells anti-CD3-FITC，anti-CD4-Percp-cy5,,92,5.淋巴细胞亚群的检测、分选 细胞表面标志 1）流式细胞仪 2）磁珠分选,MD0651.01,MACS® 磁性分选示意图,MACS微珠进行磁性标记,未标记的细胞先行流出,洗脱阳性分选的细胞,,,The end,95,