1、比色法测定大蒜总皂苷含量罗红 1,2 刘福玉 2 李慧 2 高钰琪 2（第三军医大学高原医学系： 1 高原军队卫生学教研室， 2 病理生理学教研室，高原医学教育部重点实验室，全军高原生理与高原病研究重点实验室，重庆，400038）摘 要：目的 建立一种大蒜总皂苷含量的测定方法。 方法 以薯蓣皂苷元为对照品，香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法测定大蒜总皂苷含量。结果 对照品在 1.6713.34g/ml 范围内与吸光度呈良好线性关系, 回归方程为: A = 0.014C - 0.012，( R =0.999)，平均回收率 97.8%, RSD=1.98%。方法学考察各项指标均符合要求。结论 总皂苷测定
2、方法简单，准确性、稳定性和重复性良好，可作为大蒜总皂苷质量控制手段。关键词: 大蒜总皂苷；薯蓣皂苷元；比色法分类号： 文献标识码：ADetermination of total saponins in Garlic by ColorimetryLuohong1,2, Liu-fuyu2,Lihui2,Gao-yuqi2（ 1.Department of High Altitude Military Hygiene， 2. Department of Pathophysiology and High Altitude Physiology, Key Laboratory Of High Alti
3、tude Medicine, Ministry Of Education,The key laboratory of High Altitude Physiology and High Altitude disease, PLA, College of High Altitude Medicine, Third Military Medical University， Chongqing 400038, China）Abstract Objective To develop a method for content determination of total saponins in garl
4、ic. Methods Diosgenin was used as a reference substance, and vanillin-perchloric acid was applied to determine the content of saponins at 532 nm. Results The calibration curve of diosgenin showed good linearity in the range of 1.6713.34g/ml, and the regression equation was A = 0.014C - 0.012，R= 0.99
5、9, the average recovery of control compound is 97.8%, RSD=1.98%. All the indexes of the methodological investigation met the requirements. Conclusion The determination method is simple, rapid, sensitive and accurate, which can be used for evaluating the extraction quality of total saponins.key words
6、：garlic total saponins； diosgenin; Colorimetry大蒜在全世界普遍种植，是药食同源植物，在人们日常膳食中具有重要地位。大量实验证明，它不但有抗菌、消炎、杀虫等作用，也有降血脂、降血压、抗风湿、抗肿瘤、调节机体免疫力和抗氧化等多种重要生理功效 1-4。大蒜成分复杂， 主要有含硫有机化合物、糖类、氨基酸类、脂类、维生素、微量元素和皂苷类等多种成分。目前认为其活性成分主要是含硫有机化合物和皂苷类。大蒜中已发现多种皂苷，主要是呋甾皂苷和螺甾皂苷。大蒜皂苷具有降胆固醇、抗真菌、保护心血管系统等生物活性作用 5-8。然而，关于大蒜皂苷含量测定的研究很少，大蒜总皂苷
7、含量分析方法亦未见文献报道。本实验以薯蓣皂苷元为对照品，参考收稿日期：2009作者简介：罗红,女,四川大竹人，博士研究生,讲师，发表论文7篇，主要从事高原环境营养与药物方面的研究。电话： (023) 68753714, E-mail: 通讯作者：高钰琪，电话（023）68752331，E-mail: gyqmail. tmmu. com. cn其他植物皂苷含量测定方法 8-11 ，采用香草醛- 冰醋酸-高氯酸比色法测定大蒜总皂苷相对含量，并进行方法学考察, 以建立一种大蒜总皂苷含量测定方法，为大蒜总皂苷的质量控制提供依据。1 材料与方法1.1 材料、试剂和主要仪器蒜粉（山东临沂，批次20070
8、518） 、薯蓣皂苷元(中国药品生物制品检定所，批号1539-200001)，无水甲醇、 无水乙醇、正丁醇、冰醋酸、高氯酸和香草醛等均为分析纯，大孔树脂D101( 天津海光化工厂 )。精密电子天平(0.1mg)、恒温水浴锅、漩涡混合器、Synergy HT多功能酶标仪（美国基因有限公司） R-205型旋转蒸发器（瑞士BCHI） 、J-30I 冷冻离心机（美国贝克曼） 、HLC-1型高效液相紫外监测仪（上海） 、FB-2型恒流泵（上海） 。1.2 大蒜皂苷含量测定1.2.1供试品液的配制200g蒜粉用56倍体积的60乙醇浸提48h2次（充分搅拌） ，滤过, 滤液蒸去乙醇，水溶液过D101大孔树脂
9、柱，先用蒸馏水洗柱，再用 70乙醇洗脱，高效液相紫外监测仪检测上样和洗脱曲线。收集乙醇洗脱液，蒸去乙醇并浓缩水溶液，冷冻干燥得样品。取少量样品进行皂苷发泡性、氯仿- 硫酸反应（salkowski反应）等检识试验。精密称取样品加适量甲醇充分溶解，1000g离心10min，上清作供试品溶液。1.2.2 对照品试液的配制 精密称取薯蓣皂苷元对照品，精确配制成1mg/ml甲醇溶液，作为对照品溶液。1.2.3 测定波长的选择精密吸取供试样品和薯蓣皂苷元对照品溶液各60L, 分别置15mL离心管中, 60水浴中蒸干甲醇, 精密加入新鲜配制的5%香草醛- 冰醋酸溶液0.2ml,高氯酸0.8ml, 混匀, 紧
10、盖, 60水浴中加热15min, 立即用自来水冷却, 加冰醋酸5ml, 混匀,于400600nm扫描。1.2.4 线性关系考察精密吸取薯蓣皂苷元对照品(1mg/ml) 10L、20L、30L、40L、50L、60L 、70L、80L至具塞试管中，挥干溶剂, 按“1.2.3”项下方法显色, 随行试剂为空白，于532nm 测定吸光度。以薯蓣皂苷元对照品的浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 1.2.5 稳定性试验 精密吸取供试样品和薯蓣皂苷元溶液各 50L，每隔 10 分钟测定其吸光度。1.2.6 精密度试验 精密吸取薯蓣皂苷元对照品溶液(1mg/ ml)50L 共 7 份，分别测定其吸
11、光度。1.2.7 重复性试验 精密吸取供试样品液 50L，按“1.2.3”项下方法显色，测定吸光度，共测定同一批次样品 6 份，供试品溶液制备按“1.2.1”项下方法。1.2.8 回收率实验 精密吸取供试品液，精密加入一定量对照品溶液，按照样品含量测定方法进行测定，计算加样回收率。1.2.9 样品测定 精密称取各批号供试品适量，制备供试品溶液，依上述方法显色，测定其吸光度，并按标准曲线法计算总皂苷含量。 2 结果2.1 大蒜总皂苷含量测定方法的建立2.1.1 检识试验表明，样品具有发泡性、硫酸反应和 Salkowski 反应均为阳性，说明样品中含有皂苷类物质。2.1.2 测定波长的选择对照品和
12、供试品溶液显色后均在 532nm 附近有最大吸收波长,故选择 532nm 为测定波长。2.1.3 线性关系考察薯蓣皂苷元对照品浓度在 1.6713.34g/ml 范围内与吸光度呈良好线性关系, 回归方程为: A = 0.014C - 0.012， R =0.999。2.1.4 稳定性试验：0.5h 内薯蓣皂苷元测定值 RSD=1.17（n=4） ，大蒜总皂苷提取物测定值 RSD=1.26（n=4） 。说明供试样品液和对照品在 0.5 小时内测定基本稳定。2.1.5 精密度试验：RSD=0.85% (n=7)2.1.6 重复性试验 RSD=1.17%（n=6 ） 。2.1.7 回收率实验 平均回
13、收率为 97.8%，RSD=1.98%。见表 2。2.1.8 样品测定 结果见表 3。表 2 加样回收实验结果样品 样品总皂苷含量( mg)加入对照品 ( mg)测得量( mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1 0.02008 0.01429 0.03391 96.82 0.01494 0.01667 0.03118 97.43 0.01179 0.025 0.03588 96.34 0.009395 0.03 0.03957 100.697.8 1.98表 3 样品测定结果 （皂苷含量以薯蓣皂苷元计）样品批次 大蒜总皂苷（mg） 皂苷含量(%) RSD(n=8)20070628 2
14、43 15.84 0.1620070730 378 14.53 0.2120071019 496 12.47 0.17%3. 讨论文献报道的总皂苷含量测定方法主要为比色法，比色法的显色反应灵敏，操作简单，成本低，同时也适合总皂苷的测定。关于大蒜总皂苷含量的测定方法目前还未见文献报道。大蒜皂苷属于甾体皂苷，甾体皂苷在紫外区仅有较弱的末端吸收，HPLC等其他检测方法存在一定的困难。本实验参考其他植物总皂苷含量测定方法 8-11，采用比色法测定了大蒜总皂苷含量。本实验以薯蓣皂苷元为对照品，采用香草醛-冰醋酸- 高氯酸比色法在 532nm 测定大蒜总皂苷含量。其原理是通过皂苷和皂苷元与香草醛、高氯酸反
15、应，在可见光区获得稳定的特征吸收峰。方法学考察表明，该方法精密度和重复性良好，平均加样回收率达97.8（RSD=1.98%） ，准确度较高。此外，该方法具有简单、快速等优点。值得注意的是，不同显色温度和显色时间下所测定的吸光度有显著差异，实验中必须严格操作,保证结果的可靠性。薯蓣皂苷与大蒜皂苷同为甾体皂苷，在没有大蒜皂苷对照品的情况下，本方法可作为大蒜总皂苷质量控制的可行手段。参考文献（References）:1 Kik C, Kahane R and Gebhardt R. Garlic and healthJ. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 2001,11(4)：5
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