1、1细胞凋亡的几种常见检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种用流式细胞仪进行测定的方法。一、AnnexinV/PI 法在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白 V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与 PS 具有高度的结合力。因此，AnnexinV 可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能
2、够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。方法： 1、悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.51106）用 PBS 洗 2 次，加入100ulBindingBuffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光 30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min 后，加入2400ulBindingBuffer，立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1h） ，同时以不加 AnnexinV-FITC 及PI 的一管作为阴性对照。 2、贴
3、壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。注意事项：1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。二、Hoechst33342/ PI 法：单纯的 PI 染色能够观察 DNA 直方图上凋亡细胞的亚 G13峰，但只能代表 G0/G1 期发生凋亡，无法观察 S 期和 G2 期发生的细胞凋亡。而且，细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。Hoechst 33342 可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞，与 DNA 结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。 PI 不能穿透细胞膜，对于
4、具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI 可以穿透细胞膜使坏死细胞着色产生红色荧光。Hoechst 33342/PI 双染后，可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在二元直方图上，正常细胞对 Hoechst33342 具有拒染性，呈弱蓝色荧和弱红色荧光（Hoechst 33342+/PI+） ；凋亡细胞对 Hoechst33342 具有嗜染性呈强蓝色荧光+弱红色荧光（Hoechst 33342+/PI+） ；坏死细胞对 PI 具有嗜染性，呈弱蓝色荧光强红色荧光。正常细胞样品 经处理样品4注意事项：1、 荧光染料都存在淬灭的问题，建
5、议染色后尽快检测。2、 在细胞离心的过程中，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。3、 Heochst 33342 与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min 以内。太长容易引起 Heochst 33342 的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变。 4、PI 对人体有一定危害性，请注意适当防护。三、JC-1 法（线粒体膜势能的检测）：线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位y 的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦
6、线粒体y 崩溃，则细胞凋亡不可逆转。JC-1 为阳离子脂质荧光染料，有单体和多聚体两种存在状态，两者的发射光谱不同。正常健康线粒体的膜电位（y ）具有极性， JC-1 依赖于y 的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光；而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1 从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质5内，发绿色荧光。方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入 JC-1孵育液， 37C 平衡 30min，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。正常细胞 JC-1 检测 诱导 JC-1 检测 注意事项：1、始终保持平衡染液中 pH 值的一致性，因为 pH 值的变化将影响膜电位。2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。
