1、第11章 发酵产物的提取与精制,发酵产物的提取与精制属于发酵工程的下游加工技术。下游加工亦称发酵后处理，是指从发酵液或酶反应中分离纯化目的产物并加工成成品的过程。在多数情况下是从稀的发酵液中回收目的产物，整个过程有多项单元操作组成，其中有许多是经典的化工单元操作。,9.1 下游加工过程概述,一、下游加工过程的重要性,1. 获得商业产品的关键环节。,2. 促进发酵工程上游加工技术或工艺的改进。,3. 拥有市场竞争力的重要保证。,二、下游加工工程的一般流程,1. 粗分离阶段（1）发酵液的预处理和固-液分离。（2）产物的初分离。2.纯化精制阶段（3）产物的高度纯化。（4）成品加工。,预处理,破碎细胞
2、,碎片分离,细胞分离,精制,成品加工,F发酵液,提取,加热 沉降 均化 离心分离 沉淀 层析 无菌过滤 调pH 离心分离 研磨 萃取 吸附 离子交换 浓缩 絮凝 过滤 溶胞 超滤 萃取 亲和 超滤 膜分离 双水相萃取 超滤 憎水 冷冻干燥 吸附 喷雾干燥 电泳 结晶,发酵液,胞外产物,操作步骤减至最少，并尽可能提高各步骤的收率,一、发酵液的一般特征 1. 含水量高，一般可达9099%，处理体积大。 2. 产品浓度低。 3. 悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大。 4. 固体粒子可压缩性大，一压缩就变形。 5. 液体黏度大，大多为非牛顿型流体。易吸附在滤布上。 6. 产物性质不稳定，不耐热、等会酸碱
3、敏感、易被氧化、易被微生物污染及酶分解。,9.2 发酵液的预处理与固-液分离,二、发酵液预处理的目的和要求1.预处理的目的 （1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率 （2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体） （3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。,2.发酵液预处理的要求: （1）菌体的分离 （2）固体悬浮物的去除 （3）蛋白质的去除 （4）重金属离子的去除 （5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除 （6）改变发酵液的性质 （7）调节适宜pH值和温度,三、发酵液预处理的方法,1. 降低液体的黏度2. 絮凝法3. 重力法4. 等电
4、点法5. 加入助滤剂6. 缴入反应剂,1 降低液体黏度,（1） 加水稀释法 采用加水稀释法虽然能降低液体黏度，但是会增加发酵液的体积，因此加大后续过程的处理量。 而且稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才算真正有效，即若加水一倍，则稀释后液体的黏度必须下降50%以上，才能有效提高过滤效率。,（2）加热法,升高温度可以降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度，提高过滤效率。 不适用热敏性的物质，而且要防止加热导致细胞溶解，胞内物质外溢。,（3）添加酶制剂,比如：加酶将多糖转化为单糖,凝聚是在高价无机盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体
5、系不稳定的现象。 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。,凝聚和絮凝的概念,扩散双电层的结构模型图胶粒能保持分散状态的原因,2. 凝聚和絮凝法,凝聚技术,扩散双电层的结构模型图,凝聚原理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子。,胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构，一旦由于布朗运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生使两个粒子分开：从而阻止了粒子的聚集。电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大， 此
6、外，由于胶粒表面的水化作用，形成了包围于粒子周围的水化层，也能阻碍胶粒间的直接聚集。 但是，水化膜主要是伴随胶粒带电而引起的，一旦电位降低或消除，水化层也会随之减弱或消失。,常用的凝聚剂Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCl2阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+,常用的凝聚方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。,絮凝原理：在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。,絮凝剂通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈
7、地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架连接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。,常用的絮凝剂：明胶、甲基纤维素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠,+,- -,3. 重力法,在工业上用的较多的主要是离心和过滤. 过滤常用板框真空吸滤或电动筛等，离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素。,一般温度高，压力大，发酵液粘度小，滤布选用适当，助溶剂
8、适宜，搅拌都可以提高过滤速度。,4、等电点法,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。胶体粒子的稳定性和其所带电荷有关。蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。因此可利用此特性分离或去除良性物质。因为羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.05.5）。,5、添加助滤剂： 一般为惰性助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质 作用：助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性 使用方法（1）：在滤布上预涂，作为过滤介质使用 （2）：按
9、一定比例混入待滤的悬浮液中 常用的助滤剂：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙,6、添加反应剂： 添加可溶解的盐类，生成不溶解的沉淀； 生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构； 沉淀本身可作为助滤剂，还能使胶状物和悬浮物凝固。,四、发酵液的相对纯化,1.高价无机离子的去除（Ca2+、Mg2+、Fe2+等）2.可溶性杂蛋白的去除,高价无机离子的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。杂蛋白质的存在，不仅在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低其吸附能力，而且在采用有机溶剂或两水相萃取时，容易产生乳化，使两相分离不清，在预处理时，应尽量除去这些物质。,1 高价
10、无机离子的去除,发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最大的是高价无机离子（Ca2、Mg2、Fe2）等。,去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的场合，可用其可溶性盐，草酸价格昂贵，注意回收。去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。去除铁离子：可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。,2. 杂蛋白质的除去（1）沉淀法 加热变性 蛋白质从有规则排列变为不规则结构的过程称为变性。使蛋白质变性的方法有：加热，调节pH，加酒精等有机溶剂或表面活性剂等 。 在链霉素生产中，在pH3.0时，加热至7075，维
11、持30min，黏度降为1/6，过滤速度提高3倍。,变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。, 加有机溶剂、表面活性剂、酸碱等 在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀； 在碱性溶液中，蛋白质能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。,（2）吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 例如：在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他
12、不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而可加快过滤速率。,9.3 固-液分离过程及设备简介,意义：固-液分离过程下游加工的重要环节，用于发酵液的预处理和生物产品的纯化、精制等环节。,方法：常用的方法有过滤、离心。此外还有膜分离、双水相萃取和扩张床吸附等方法。,影响发酵液固-液分离的主要因素：菌体的大小、形状及发酵液的黏度，还有发酵液的温度、pH值、加热时间等。,目的：收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。,1. 过滤,定义：用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程。,常用的过滤方式：加压
13、过滤和真空过滤,典型设备主要有：板框压滤机和鼓式真空过滤机,（1）板框过滤机,板框压滤机由压滤机滤板、液压系统、压滤机框、滤板传输系统和电气系统等五大部分组成。,真空转鼓过滤机,优点： 真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大（10）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。缺点： 由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。,2、离心,定义： 基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。,离心分离方法,(1)差速离心工业上最常
14、用的离心分离方法,定义：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。对象：混合样品中各沉降系数差别较大的组分。,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,原理：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。分类：1）移动区带离心 2）等密度离心常用密度梯度物质：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr,(2)密度梯度离心多用于生化研究,1）移动区带离心,含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时，每种颗粒都达到其最大沉降速度，这时样品开始分离。离心管的上层逐渐形成透明的上清液，并形成对应于样品各组分的一系
15、列浓度界面，界面的移动相对于每种组分来说是特征的。 用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。此法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,2）等密度离心,细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在该层达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。,离心机分类,制备性离心机,分析性离心机：超速离心机,普通离心机,高速冷冻离心机,超速离心机,实验型离心机,工业型离心机,碟片式离心机是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。分离因数可达1000-20000，最大处理量达到300m3/h，常用于大规模的分离过程。
16、适用范围 细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片。,管式离心机管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，分离因数可达104-6105。它设备简单、操作稳定。适用范围细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。,3. 其他固-液分离方法,（1）膜分离：利用不同组分通过膜的传递速度不同而得以 分离的方法,（2）双水相萃取：利用不同组分在双水相分配系数不同进 行分离方法。,（3）扩张床吸附：将固-液分离合目的产物吸附合并成一步进行的一种分离方法。,11.4 微生物细胞的破碎,微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首先要
17、收集菌体，进行细胞破碎。,1. 微生物细胞壁的组成与结构：（1）细菌细胞壁：（2）酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。（3）其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。,2. 常用的细胞破碎方法,细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。亦可按所用方法的属性分为物理法、化学法和生物法三类。物理破碎法：高压匀浆法、挤压法、高速珠磨法、超声波法；化学破碎法：渗透冲击法、增溶法。生物破碎法：酶溶法,细胞破碎机理图,11. 5 浓缩技术,浓缩过程是发酵工业提取与精制过程常用的单元操作。浓缩的目的是将低溶质浓度的溶液通过除去
18、溶质变为高溶质浓度的溶液。它广泛用于有机酸、氨基酸、核苷酸、酶制剂及抗生素等发酵工业产品的提取分离过程。常用的浓缩技术有蒸发浓缩法、冷冻干燥法、吸收浓缩法。,（1）蒸发浓缩法,蒸发浓缩法概念及原理,蒸发是工业发酵生产过程中常用的发酵产品浓缩方法之一。蒸发的目的是使溶液中的溶剂在一定的温度和压力下加热后汽化除去，从而提高溶液中溶质的浓度。这里所指的溶液是由不挥发的溶质与液体溶剂所组成，蒸发过程只有溶剂汽化而溶质不汽化。,蒸发浓缩装置的设计,蒸发是溶液表面的溶剂分子获得的动能超过了溶液内溶剂分子间的吸引力脱离液面进入空间的过程。蒸发快慢与温度、蒸发面积及液面蒸汽分子密度等因素有关。因此，蒸发浓缩装
19、置常按照加热、扩大液体表面积、减压、和加速空气流动等因素而设计,蒸发浓缩装置的分类,常用的蒸发浓缩过程可分为常压蒸发浓缩和真空减压蒸发浓缩过程。按照结构型式不同，常压蒸发设备有中央循环管式蒸发器、横管式蒸发器、夹套式蒸发器、夹套带搅拌外循环蒸发器、强制循环蒸发器等.真空减压蒸发设备根据二次蒸气的利用的情况，可分为单效蒸发和多效蒸发。,分子蒸馏,分子蒸馏克服了传统蒸馏操作温度高，受热时间长等缺点，可解决大量传统蒸馏无法解决的工业化难题，尤其适用于目标产物与杂质之间沸点相差较大的物质的分离。 分子蒸馏的原理是根据分子运动理论，液体混合物的分子受热后运动会加剧，当接受到足够能量后，就会从液体溢出而成
20、为气相分子。,2、冷冻浓缩法,冷冻浓缩法：是工业发酵中生物大分子和具有生理活性的发酵产品浓缩常用的一种有效方法。,冷冻浓缩法原理：在冷冻时水分结成冰，盐类及发酵产品不进入冰内而留在冰外，浓缩时先将待浓缩的溶液冷冻使之变成固态，然后缓慢的融解，利用溶剂与溶质熔点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如酶制剂和蛋白质。,3 吸收浓缩法,吸收浓缩法：是一种通过吸收剂直接吸收出去溶液中溶剂分子使溶液浓缩的方法。,应用吸收浓缩法时要求吸收剂不与溶液起化学反应，而且对大分子类的发酵产品不起吸收作用，易于溶液分开，吸收剂除去溶剂后能重复使用。,11.6 沉淀技术,定义：通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开
21、溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。,作用：浓缩作用大于纯化作用，是初步分离的一种手段。,优点：沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点。,缺点：于过滤困难、产品质量较低、需要重新精制。,1. 盐析,原理：高浓度中性盐存在下，使生物分子在水溶液中溶解的溶解度降低而产生沉淀的方法，多用于蛋白质（酶）的分离。,常用的盐类是硫酸铵。,优点： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。,（1）盐析机制,盐溶：盐低时，S（蛋白质的溶解度）随盐增加而增加；盐析：盐高时，S（蛋白质的溶解度）随盐增加而降低；,（2）溶解度与盐浓度的关系
22、可用下式表示： log S=KSI S：蛋白质的溶解度； I：离子强度； ：常数，与蛋白质种类有关，与盐的种类无关； KS ：盐析常数，与盐种类有关，与温度和pH无关；,盐的种类：影响KS，KS越大，效果越好 溶质的起始浓度 盐析剂用量温度和pH：影响值而影响S。尤其是影响相对溶解度杂质,（3）影响盐析的因素,2. 等电点沉淀,原理：利用两性电解质在在低离子强度下，调节至等电点，可使各种两性电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解度，形成沉淀。,不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。,优点：操作简单，试剂消耗少，引入杂质少。,缺点: 不能完全沉淀析出，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他
23、沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,应用：主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,等电点操作时要注意： 溶液中离子的种类和浓度对生物分子等电点的影响。 等电点附近的盐溶作用 目的产物的不稳定性。,等电点锌盐法,3. 有机溶剂沉淀,定义：于水互溶的有机溶剂（乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。多用于生物小分子、多糖、核酸和蛋白质等产品的提取。,机理：降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。,常用有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮等。,缺点：容易引起蛋白质变性失活，并且有机溶剂易燃、易爆，对
24、安全要求较高。,优点：分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀不需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离；有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，适用于食品、药品的制备。,4. 非离子型多聚物沉淀,定义：水溶性的非离子多聚物如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等，可用于沉淀分离蛋白质（尤其是不稳定的蛋白质）、DNA和RNA等。,机制：多聚物与有机溶剂相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大分子形成复合物，发生共沉淀作用等,应用最多的是PEG。,优点：其操作条件温和，不易引起生物大分子的变性，沉淀效能高，很少量的沉淀剂就可以使相当多的生物大分子沉淀，且
25、沉淀后的多聚物也容易除去，无毒、不可燃，对大多数蛋白质有保护作用。,应用：广泛用于蛋白质、核酸、细菌和病毒等的分离纯化。,11.7 萃取分离技术,定义：利用不同物质在选定溶剂中具有不同的溶解度的原理来进行不同物质的分离纯化。,优点：选择性好，分离效果好； 对热敏性物质破坏小，且耗能低； 生产能力大，周期短； 便于连续操作，容易实现自动化控制等。,应用：适用于抗生素等小分子物质的分离纯化,定义：是利用萃取目标物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂从而实现分离。,1. 溶剂萃取,在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，从料液中提取出来的物质称为溶质，用来进行萃取的溶剂称为
26、萃取剂，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液为萃取液，被萃取出溶质的料液称为萃余液。,（1）生产中萃取操作一般应包括下面三个过程 混合料液和萃取剂密切接触； 分离萃取相与萃余相分离； 溶剂回收萃取剂从萃取相(有时也需从萃余相)中除去，并加以回收。,萃取操作流程分为单级萃取和多级萃取，多级萃取又分为多级错流萃取和多级逆流萃取。,（2）溶剂的选择,萃取用的有机溶剂应对产物有较大的溶解度和良好的选择性。遵循一个简单的规律：“相似物容易溶解在相似物中”，即分子的极性。极性液体互相混和并溶解盐类和极性固体，而非极性化合物溶剂是低极性或没有极性的液体。,选择溶剂时还应注意： 与料液的互溶度应尽可能小； 毒
27、性低； 化学稳定性高，腐蚀性低，挥发性小； 价格便宜，来源方便，便于回收。,工业上常用的溶剂：乙酸乙酯、乙酸戊酯和丁酯等。,（3）水相条件的影响, pH值：直接影响表观分配系数。另外对选择性有影响。 温度：温度会影响生化物质的稳定性，所以一般在室温或低温下进行。同时影响分配系数K和萃取的速度。 盐析：硫酸铵、氯化钠等可降低产物在水中的溶解度，还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。 带溶剂：能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，提高分配系数。,（4）乳化和去乳化,定义：乳化是一种液体(分散相)分散在另一种不相混溶的液体(连续相)中的现象。,害处：乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难，产生
28、乳化后使有机相和水相分层困难，,原因：是发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活剂性的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型W/O乳浊液；相反，为O/W型乳浊液。, 乳化,方法： a. 过滤或离心分离破乳法； b. 化学法：加电解质中和离子型乳油液的电荷； c. 物理法：加热、稀释、吸附等； d. 顶替法：加入表面活性更大，但因其碳链较短难以形成坚固的保护膜的物质，取代界面上的乳化剂； e. 转型法：如在O/W中加入亲油性乳化刑，使乳化液有生成W/O的倾向，但又不稳定，从而达到破乳目的。最好的方法是防止乳化，如蛋白质是乳化起因，就应设法
29、去除蛋白质。,去乳化：破坏乳浊液,（5）萃取的方式,根据混合- 分离的操作方式，可以分为单级萃取和多级萃取。,单级萃取：只使用一个混合器和一个分离器的萃取。 特点：流程最简单，单收率不高。,多级错流萃取：每级都加入新鲜萃取溶剂，溶剂消耗多，萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。,多级错流萃取（F料液；S溶剂；L萃取液；R萃余液）,多级逆流萃取：料液走向与萃取走向相反，萃取剂只在最后一级加入，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。,多级逆流萃取 （F料液；S溶剂；L萃取液；R萃余液）,2. 双水相萃取法,定义：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。,（1）双水相
30、形成,大多数亲水性聚合物水溶液与第二种亲水性聚合物混合，达到一定浓度时，会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。,高聚物之间的不相溶性，使得它们无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向，在一定条件下，即能分为两相。,聚合物与盐类溶液也能形成两相。,（2）影响双水相分配的因素, 成相聚合物的相对分子质量 成相聚合物的浓度 盐的种类和浓度 pH 温度,（3）双水相萃取的应用,可用于分离和纯化酶、核酸、生长素、病毒、干扰素等。,常用的双水相系统为聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐，后者中聚乙二醇/硫酸盐或磷酸盐系统最为常用。,目的分子与杂质（如细胞等）应分配在不同的相。分配系数应足
31、够大。容易离心分离。,（4）两水相分离条件,3. 反胶团萃取,定义：利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成的内含亲水微环境的反胶团，使生物分子溶于此亲水微环境，进而进行萃取的分离方法。,若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过某一临界浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，称为反胶束，,在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解于水后，就形成了“水池”。,反相胶团萃取的优点：,成本低选择性高操作方便放大容易萃取剂 (反胶团相 )可循环利用蛋白质不易变性等优点。,4. 超临界流体萃取,定义：是将超
32、临界流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某些高沸点或热敏性成分，达到分离和提纯目的。,超临界流体是物质处于临界温度、临界压力之上的一种流体状态，具有气体和液体双重，即密度接近液体，而黏度与气体相似，扩散系数约比液体大100倍。不仅具有与液体溶剂相当的萃取能力，而且具有传质扩散速度快的优点。,具有较高的扩散性，从而减小了传质阻力，这对多孔疏松的固态物质和细胞材料中的化合物的萃取特别有利。对改变操作条件(如压力、温度)特别敏感，这就提供了操作上的灵活性和可调性。具有低的化学活性和毒性。,（1）超临界流体具有以下特点：,超临界CO2成为目前最常用的萃取剂，它具有以下特点： 1. CO2临界温度为31
33、.1，临界压力为7.2MPa，临界条件容易达到。 2. CO2化学性质不活波，无色无味无毒，安全性好。 3. 价格便宜，纯度高，容易获得。因此，CO2特别适合天然产物有效成分的提取。,（2）超临界CO2的特点：,（3）应用,超临界萃取技术具有低能耗。无污染和适用于分离易受热分解的高沸点物质的优点。最适用于分离价值高、难于用常规方法分离的生物化合物。除了用在化工、医药等行业外，还可用在烟草、香料、食品等方面。,超临界流体萃取过程由萃取阶段与分离阶段组成分离,（4）超临界萃取典型流程,等温法：等温条件下，萃取相减压、膨胀，溶质从分离槽下部取出。气体经压缩机加压后返回萃取槽。等压法：等压条件下，萃取
34、相加热、升温，气体和溶质分离。溶质从分离槽下部取出，气体冷却、压缩后回到萃取槽。吸附法：溶质被分离槽中的吸附剂吸附，气体压缩后回到分离槽。,等温法（T1=T2，P1P2）,等压法（T1T2，P1=P2）,吸附法（T1=T2，P1=P2）,11.8 膜分离法,定义：是物质通过膜的传递速度不同而得到分离。,优点：过程一般较简单，操作方便，费用较低，效率较高，无相变，可在常温下操作，既节能又特别适用于热敏性物质的分离纯化，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及。,1、膜分离特点 膜的种类、孔径可以根据需要选择 膜对于阻止大的粒子或分子透过的能力很强 把产物分在两侧，很容易收集样品 节能、环保,膜的特
35、性及分离原理,所谓的膜，是指在一种流体相内或是在两种流体相之间有一层薄的凝聚相，它把流体相分隔为互不相通的两部分，并能使这两部分之间产生传质作用。 膜的特性： 不管膜多薄, 它必须有两个界面。这两个界面分别与两侧的流体相接触 膜传质有选择性，它可以使流体相中的一种或几种物质透过，而不允许其它物质透过。,膜分离过程原理：以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电压差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。,膜上游 透膜 膜下游,分离膜种类,分离膜,膜分离的物理化学原理,截流机理和筛孔效应渗透和渗透压 Don
36、nan效应,机械截留（筛孔效应） 物理作用或吸附截留架桥作用网络内部截流,2. 膜分离方法的分类,透析超滤反渗透微滤电渗析液膜技术气体渗透渗透蒸发,（1）微滤：微孔过滤，利用孔径0.025m14m的多孔膜，过滤含有微粒的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、分离和浓缩的目的。推动力为压力差，通常为0.1MPa0.5MPa。（2）超滤：滤膜孔径为lnm20nm，用于过滤含有微粒和大分子的溶液。以压力差为推动力，通常为0.1MPa0.6MPa。,（3）反渗透：用反渗透膜(孔径0.1nm1nm)，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜，截留所有可溶物而得到分离的操作。反渗透也是以压力差为推动力，操作压达3
37、MPa10MPa。,3. 膜的材料、结构和性能参数,膜的要求：透过速度大，选择性高，非特异性吸附低，机械强度好，不易被微生物侵袭，耐热、可高温灭菌，耐化学试剂，廉价等。,（1）制膜的材料,种类：天然高分子材料、合成高分子材料和特殊材料。,实际应用中，目前以纤维素膜和聚砜膜使用最广。,（2）表征膜性能的参数,孔径的性质(包括孔径、孔径分布和孔隙度)水通量截留率和截断分子量抗压能力pH适用范围对热和溶剂的稳定性。,4. 膜的污染与清洗,污染：膜在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象。原因：膜与料液中某一溶质的相互作用，或吸附在膜上的溶质和其它溶质的相互作用而引起的。,（1）膜的污染
38、,膜的清洗方法 a. 机械方法：加海绵球，增大流速，逆洗（对中空纤维超滤器），脉冲流动，超声波等。 b. 化学方法：水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、螯合剂、过氧化氢、酶溶液等清洗剂。,（2）膜的清洗,减轻膜污染的方法 a. 对料液进行预处理 b. 制模时改变膜的表面极性和电荷,（3）过滤方式与装置,膜过滤的方式有常规过滤和切向过滤两种。,膜分离设备： 平板式膜器 管式膜器 螺旋卷式膜器 中空纤维膜器,（4）膜分离技术的应用：,菌体、细胞的分离和收集；小分子产物的纯化，如抗生素、柠檬酸等；大分子产物的纯化，主要是酶制剂等；纯水的制备；纯净水和最终制品中的除菌和除热源。作膜反应器中的分离部件。
39、,11.9 吸附分离技术,定义：利用不同组分（溶质）在吸附剂表面吸附和解吸能力的差异进行分离的方法,脱附：吸附的逆过程,吸附过程通常包括：待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。,常用于从稀溶液中将溶质分离出来，由于受固体吸附剂的限制，处理能力较小；对溶质的作用较小，这一点在蛋白质分离中特别重要；可直接从发酵液中分离所需的产物，成为发酵与分离的耦合过程，从而可消除某些产物对微生物的抑制作用；溶质和吸附剂之间的相互作用及吸附平衡关系通常是非线性关系，故设计比较复杂，实验的工作量较大。,1. 吸附法的特点：,优点：有机溶剂掺入少 操作简便，安全，设备简
40、单 pH变化小，适于稳定性差的物质,缺点：选择性差收率低无机吸附剂性能不稳定不能连续操作，劳动强度大碳粉等吸附剂有粉尘污染,2. 吸附机理,固体的表面性质固体表面分子（或原子）所处的状态与固体内部分子（或原子）所处的状态不同。,固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在吸附表面上形成多分子层或单分子层。,实际过程中物理和化学吸附是主要的，比较如下,2. 吸附的类型：,（1）疏水或非极性吸附剂,（2）亲水和极性吸附剂,（3）各种离子交换剂,多孔型：活性炭、硅胶、硅
41、藻土；大网格吸附剂：有机高分子材料，如聚苯乙烯，聚酯。凝胶型：纤维素凝胶，琼脂糖凝胶，匍聚糖凝胶等。,吸附分离介质,（1）吸附树脂指的是一类高分子聚合物。常用的有聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸酯树脂等。吸附树脂品种很多，单体的变化和单体上官能团的变化赋予树脂以各种特殊的性能。（2）吸附树脂分为非极性、中极性、极性及强极性四类。（3）吸附树脂可用于除去废水中的有机物，糖液脱色，天然产物和生物化学制品的分离与精制等。,吸附树脂,1)组成结构：有机高分子聚合物的多孔网状结构2)特点：选择性好；解吸容易；机械强度好；流体阻力较小；价格高3）类型：非极性吸附剂芳香族（苯乙烯等） 中等极性吸附剂脂肪族（甲基丙烯酸
42、酯等） 极性吸附剂含硫氧、酰氨、氮氧等基团,吸附, 冲洗 和 洗脱,时间/体积,y,吸附,冲洗,洗脱,吸附过程的影响因素,1. 吸附剂的特性（组成结构、容量、稳定性 ）2. 吸附物的性质（熔点、缔合、离解、氢键等）3. 溶剂（单、混合）4.吸附操作条件1）温度2）pH值3）盐的浓度,应用： 大孔吸附树脂广泛应用于制药及天然植物中活性成分如皂甙、黄酮、内脂、生物碱等大分子化合物的提取分离。 对人参皂甙、三七皂甙、淫羊藿黄酮、大豆异黄酮、茶多酚、洋地黄强心甙、麻黄精粉、柚甙、红豆杉生物碱、多种天然色素、中药复方药物提取等以及生物化学制品的净化、分离、回收都有良好的效果。 并在抗生素、维生素、氨基酸
43、、蛋白质提纯，生化制药方面有很广泛的应用。,11.10 离子交换层析技术,定义：利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行。 优点：灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。,（1）离子交换剂的组成结构及其特性,（2）离子交换树脂的形状结构示意图,示意图（离子交换过程）,电离基团（磺酸根）,可交换离子（钠离子）,交换离子,不交换离子,三、离子交换柱层析原理示意图,柱层析系统的组装,线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱,11.11 凝胶色谱技
44、术,凝胶过滤法又称为分子筛层析，是利用凝胶的网状结构为固定相，根据分子大小进行分离的一种方法。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。单个凝胶珠本身象“筛子”，不同类型凝胶的筛孔的大小不同。,Services,基本原理,凝胶过滤层析过程示意图,（1）要分离的分子分为三类： A类：dA最大孔径，全排阻（出） 凝胶对它无阻滞，最早流出； C类：dC最小孔径，能进入全部孔隙区，阻滞最大，流速最慢，最晚流出； B类：最小孔径dB最大孔径，进入部分孔隙区大小不同B类分子之间阻滞不同，可以分离把B类分子的分离称为分级分离BB 把A、B、C类分子间分离称为组别分离A B C,典型的凝胶类型,交联葡聚糖凝胶：Sephadex聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等。,11.12 亲和层析技术,定义：利用生物分子物质具有的特异的亲和力而进行分离的一种层析技术 。,许多生物大分子具有与其结构相对应的特异分子可逆结合的特性，如抗原与抗体、酶与底物或抑制剂、激素与受体等，这种结合往往是特异的而且是可逆的，生物大分子间的这种结合力称为亲和力。,
