1、细胞生物学实验手册前 言这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制临床专业和研究生班。细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生
2、理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。全书内容共 23 个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。教材初稿曾于 1989 年全国医学细胞生物学实验课培训班试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。现在
3、第四版在 1993 年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。 目 录前 言实验室规则 (1)常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2)细胞生物学实验绘图方法与要求（4）实验 一 动物细胞的基本形态观察和显微测量（5）实验 二 线粒体的活体染色及电镜照片观察（8）实验 三 液泡系的活体染色及电镜照片观察（10）实验 四 细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)实验 五 细胞器的光镜切片和电镜照片观察（13）实验 六 细胞生理活动的观察（16）实验 七 细胞组分的化学反应（20）
4、实验 八 细胞核与线粒体的分级分离（23）实验 九 细胞分裂的形态观察（26）实验 十 正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)实验十一 细胞融合（36）实验十二 应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本（38）实验十三 培养细胞的形态观察和计数（40）实验十四 细胞的原代和传代培养（43）实验十五 酸性磷酸酶的显示（46）实验十六 肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定（48）实验十七 电镜生物标本的制备及镜下观察（50）实验十八 整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察（54）实验十九 免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原（56）实验二十 姊妹染色单体互换标本制备与分析（58）实验二十一
5、 银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察 (60)实验二十二 染色体扫描电镜标本制备及观察（63）实验二十三 细胞显微摄影（65）附录一 离心机转数与离心力的换算表（67）附录二 溶液的配制（68）主要参考资料（77）实验室规则一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。实验中途因故需外出时应向任课教师请假。二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。四、必须严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。要爱护仪器、标本和设备。如遇仪器损坏或不灵，应及时报告任课教师，以便
6、修理或更换，不要自行乱修。损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。六、注意节约实验材料、药品和水、电等。七、保持实验室内清洁整齐。实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材清洗后点清数目，然后摆放整齐。班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关和门、窗等，经教师允许后方可离开实验室。八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。常用实验动物的了解和解剖器械的使用一、常用实验动物常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。在医学实验中，常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。例如，蟾蜍
7、可以用于观察离体心脏搏动情况的实验，小白鼠常用于样本很大的实验(如药物的半数致死量的测定等)，猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。蟾蜍蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。1雌雄鉴别通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的 l3 趾基部有被称为婚垫的黑疣。2捉拿及处死方法：常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部
8、前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约 l2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。小白鼠小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。1捉拿方法：将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。2处死方法：处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器
9、内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。3给药方法：小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针12mm 后，再以 45角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为 0.10.2ml10 克体重。二、常用手术器械及操作方法：1解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓
10、处死蟾蜍，持法如执笔法。2解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。3大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。持法如图。4眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。5眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。6钝头镊子：用于提取脏器、组织等。7有钩镊子：用于提取皮肤切口等。常用手术器械执手术刀的姿势执手术剪的姿势执手术镊的姿势执手术刀、手术剪、手术镊的姿势(张之曾编)细胞生物学实验绘图方法与要求一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行
11、描绘，要求真实、准确(注意各部结构的比例关系)。二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。 三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。实验一 动物细胞的基本形态观察和显微测量【实验目的】制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态，学会使用测微尺，通过测量对红细胞的进化进行分析。【实验用品】一、材料和标本 蟾蜍一只，人血液一滴。二、器材和仪器 配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手术器材一套、解剖盘一个、镜台测微尺一个、小平皿一
12、个、牙签。三、试剂 1甲苯胺兰、1甲基兰、Ringer 氏液(两栖类用)。【实验内容】一、细胞的基本形态观察(一)原理细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。(二)观察方法与结果1制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去
13、延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用 Ringer 氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色 10 分钟，盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染成兰紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁(参照照片)。2蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上，用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维(肌细胞)。尽可能拉直肌纤维。在显微镜下观察，肌细
14、胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边(参照照片)。3蟾蜍肝脏压片的制备与观察剪开蟾蜍腹腔，取一小块(约 23mm 3)肝放在平皿内，用 Ringer 氏液洗净，用镊子轻压将肝中的血挤出。然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。染色用甲基兰。显微镜下观察可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形(参照照片)。4蟾蜍血涂片的制备与观察取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上将另一载片的一端呈 45角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。(图 l 一 1)。晾干。显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。图 11 血涂片的制备
15、5人血涂片的制备与观察取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。自细胞数目少，为圆形。6人口腔上皮细胞标本的制备与观察用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一滴甲苯胺兰染液，染色 5 分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见复盖口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。二、测微尺的使用(一)原理测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长 1毫米(
16、1000m)，被分为 100 格，每格长度是 10 微米。(二)方法1将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数(图 12)。2按下式求出目镜测微尺每格代表的长度目镜测微尺每格代表的长度(m)= X10三、测量人口腔上皮细胞从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞核的长短径。【作 业】一、分别求出使用低倍镜(10X)，高倍镜(40X)时目镜测微尺每格代表的长度：低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= XlO(m)= m高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= XlO(m)= m二、分别绘制
17、所观察的 6 种细胞并注明基本结构。三、计算蟾蜍红细胞的核质比例。计算细胞、细胞核体积的公式：圆 形 V=4/3r 3(r 为半径)椭圆形 V=4/3ab 2(a、b 为长、短半径)核质比 ND=Vn(VcVn)(Vn 为核的体积，Vc 是细胞质的体积)实验二 线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察【实验目的】掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。【实验用品】一、材料和标本 兔子一只、线粒体的电镜照片。二、器材和仪器 显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml 注射器、吸管。三、试剂 l300 詹纳斯绿 B 染液、R
18、inger 氏液(哺乳类用)。【实验内容】一、兔肝细胞线粒体的活体染色（一）原理线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。（二）方法用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（23mm 3） ，放入盛有 Ringer 氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，
19、用吸管吸去Ringer 氏液，在平皿内加 1300 詹纳斯绿 B 染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染 30 分钟。染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴 Ringer 氏液，盖上盖片，吸去多余水分。(三)结果显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。二、线粒体的光镜切片观察 用詹纳斯绿 B 染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。三线粒体的电镜照片观察不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到
